软胶囊中花青素（以原花青素计）的测定方法验证

高秋荣

2018/07/09
国联质检团队

私聊

中药/天然药检测

西安国联质量检测技术股份有限公司

食品事业部：任乐

一、目的：对用《保健食品检验与评价技术规范》（2003版)中“保健食品中原花青素的测定”方法测定“软胶囊”中花青素的含量进行方法适用性验证。
二、验证内容：方法适用性验证包括检出限、线性范围、重复性、回收率、方法专属性。
三、验证方法：
1 范围
本标准适用于软胶囊中花青素（以原花青素计）的含量测定。
2 原理
原花青素是含有儿茶素和表儿茶素单元的聚合物。原花青素本身无色，但经过用热酸处理后，可以生成深红色的花青素离子。本法用分光光度法测定原花青素在水解过程中生成的花青素离子。计算试样中原花青素含量。
3 试剂
实验室用水为双蒸馏水，所用试剂为分析纯级。
3.1 甲醇分析纯。
3.2 正丁醇分析纯。
3.3 盐酸分析纯
3.4 硫酸铁铵 NH₄Fe(SO₄)₂·12H₂O溶液：用浓度为2mol/L盐酸配制成2%（w/v）的溶液。
3.5 原花青素标准品来源：上海源叶生物科技有限公司批号:YA0429YA14。
4 仪器和设备
4.1超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司型号：KQ5200B
4.2电子天平：沈阳龙腾电子有限公司型号：JM-B10002 精度：0.0001g
4.3分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司型号：TU-1901或同等程度仪器
以上仪器符合检测要求。
5 试样处理
样品提取：挤出软胶囊内容物，搅拌均匀，称取50-100mg胶囊内容物置于小烧杯中，用20mL甲醇分数次搅拌，将原花青素洗入50mL容量瓶中，直至甲醇提取液无色，加甲醇至刻度，摇匀。
6 测定
标准曲线绘制：称取原花青素标准品10.27mg溶于甲醇置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，该原花青素储备液的浓度为1027.0μg/mL。分别吸取原花青素储备液0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5mL置于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。
将正丁醇与盐酸按95:5的体积比混合后，取6mL置于具塞锥瓶中，再加入0.2mL硫酸铁铵溶液和1.0mL试样溶液，混匀，置沸水浴回流，精确加热 40min后，立即置冰水中冷却，在加热完毕15min后，于546nm波长处测吸光度，由标准曲线计算试样中原花青素的含量。
7 公式
试样花青素（以原花青素计）含量按下式进行计算。

式中：X—样品中花青素（以原花青素计）的含量，g/100g；
A—样品测定液中原花青素的含量，μg；m—样品质量，mg；
V-待测样液总体积，mL。
计算结果保留三位有效数字
四、验证数据
1 线性范围
以原花青素含量（C）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程：A=0.0038c+0.0035 R²为0.9996。

原花青素含量(μg)	0	10.27	25.68	51.35	102.7	154.05
A	0	0.043	0.096	0.205	0.392	0.580

以上结果表明原花青素在0-154.05μg范围内，吸光值与原花青素含量线性良好，符合要求。
2 检出限
以零点为参比，同时在546nm处对标准曲线零管进行20次测定，计算标准偏差，以3倍标准偏差值相对应的含量即位检出限。
经计算的得出，当称量为100mg时，其检出限为21.5mg/kg，符合软胶囊对浓度的要求。
3 重复性
称取6份试样按照上述处理方法进行试样处理，分别吸取适量样液进行比色，求得样液中花青素量。

测定编号	1	2	3	4	5	6
样品花青素（以原花青素计）含量g/100g	2.193	2.162	2.148	2.135	2.169	2.187
平均值g/100g	2.17
相对标准偏差%	1.0

由上表可知，试样中花青素（以原花青素计）测定的重复性均值为2.17g/100g，RSD值为1.0%，符合规定。
4 准确度
在进行重复性试验基础上，同时进行加标试验，加标量分别为1.74g/100g，2.17g/100g，2.60g/100g结果见下表：

测定编号	1	2	3	4	5	6
加标后实际含量g/100g	3.81	3.89	4.32	4.27	4.59	4.62
理论加标量g/100g	1.74	1.74	2.17	2.17	2.60	2.60
加标样品含量g/100g	1.64	1.72	2.15	2.10	2.42	2.45
加标回收率%	94.3	98.8	99.1	96.8	93.1	94.2

由上表可以看出软胶囊中花青素（以原花青素计）测定的加标回收范围在92%-105%，符合规定。
5 专属性

配制2个浓度梯度的原花青素标准溶液，1个样品处理液，1个试剂空白，按照上述处理方法进行处理，经过全波长分别扫描原花青素标准溶液，样品，试剂空白，如图所示可以看到原花青素标准品在546nm附近出现最大吸收峰，且样品在此波长处无干扰，故其专属性符合要求。

综上所述：从检出限、线性范围、重复性、准确度、方法专属性测试结果可知，均符合方法要求，本实验方法符合软胶囊花青素（以原花青素计）的测定。

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lingshike

第1楼2018/07/16

谢谢楼主的分享！
没有做过具体的保健品质量标准，特请教几个问题。
1.加标回收率92-105%范围，符合标准。这个标准的出处是哪里的？具体如何规定的，比药品要宽泛一些，想学习一下。
2.检出限，以3倍标准偏差值对应的含量为检出限，这个有点不太理解。不知具体如何计算的。
向楼主学习。