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包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测和鉴定

我是风儿

2018/10/11
鹤壁农检联合队

食品毒素/微生物检测

包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测和鉴定

致病性
• 主要致病物质是内毒素，此外尚有菌毛、荚膜、胞外酶和外毒素等多种致病因子。可引起局部化脓性炎症，也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃肠炎、心内
膜炎、脓胸，还可引起菌血症、败血症及引起婴儿严重的流行性腹泻。
国内外污染情况- 参考文献
• 国内污染情况：
-瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率1.2％～23.6％； -瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率11.6％。
• 国外污染情况：
-Richards等在104件检品中的4件分离到铜绿假单胞菌； -Rosenberg报告德国1.2％～10.2％的瓶装矿泉水检出铜
绿假单胞菌。
• 刚出厂的产品中铜绿假单胞菌数量较少，但有文献报道5加仑桶装产品（15～31天的保存期），铜绿假单胞
菌可生长繁殖达到 10^4 CFU/ml。
• 国内卫生标准：0 CFU/250ml

二、实验室检验

GB 8538-2016 铜绿假单胞菌检测（滤膜法）

原理
将250mL水样用孔径为0.45μm的滤膜过滤，并将滤膜移至CN琼脂培养基上，于36℃士1℃恒温箱中培养48h，能够在CN琼脂上生长并产生绿脓菌素，或者能够在CN琼脂上生长并且氧化酶呈阳性、紫外光（360±20nm）照射下能发荧光、能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌，经证实为铜绿假单胞菌，则其检测结果为阳性。

操作步骤-水样过滤
在100级的洁净工作台进行过滤操作。首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将250mL水样或稀释液通过孔径0.45μm的滤膜过滤，然后将过滤后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上，平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡。

可疑菌落计数情况
• 计数所有显蓝色或绿色（绿脓色素）的菌落，初步判定为铜绿假单胞菌。（需要做绿脓菌素的测定）
• 计数滤膜上所有发荧光不产绿脓色素疑似铜绿假单胞菌菌落，并进行乙酰胺肉汤确定试验。
（在紫外线下检查滤膜时，应避免长时间在紫外光下照射，否则可能会将平板上的菌落杀灭，而导致无法在证实培养基上生长。）
• 将其它所有红褐色不发荧光的菌落进行氧化酶试验、乙酰胺肉汤、金氏B培养基确证实验。

纯化
• 营养琼脂：将需验证的可疑菌落划线接种营养琼脂培养基，于36℃±1℃培养 20h～24h，对可疑菌进行纯化

将最初显红褐色的菌落进行氧化酶试验
• 氧化酶试验：
• 原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。
• 操作：取2～3滴新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里的洁净滤纸上。用铂金丝接种环或玻璃棒，将适量的纯种培养物涂布在预备好的滤纸上。在10秒内显深蓝紫色的视为阳性反应。也可以按照商品化氧化酶测试产品的说明书进行该项测试。

产氨实验（乙酰胺肉汤）
• 原理：铜绿假单胞菌产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，滴加钠氏试剂（碘化汞钾），氨在碱性条件下与碘化汞钾作用，生成红色的络合物。
•操作：将纯培养物接种到装有乙酰胺肉汤的试管中，在36℃±1℃下培养20h～24h。然后向每支试管培养物加入1～2滴钠氏试剂，检查各试管的产氨情况，如表现出从深黄色到砖红色的颜色变化，则为阳性结果，否则为阴性。

产荧光素实验（金氏B培养基）
• 原理：蛋白胨提供氮源，磷酸盐促进荧光素的产生并抑制绿脓色素的产生，硫酸镁为荧光素的产生提供必须的阳离子，琼脂是培养基的凝固。
• 操作：将上述呈红褐色的且氧化酶反应呈阳性的培养物接种于金氏B培养基上，于36℃±1℃恒温箱培养24h～5d。每天需取出在紫外灯下检查其是否产生荧光性，将5d内产生荧光的菌落记录为阳性。

计数结果说明
• 菌落计数公式：N＝P＋F(cF/nF)＋R(cR/nR)
- P是呈蓝/绿色的菌落数（所有证实为铜绿假单胞菌的菌落）。
- F是没有绿脓色素但显荧光的菌落数。
- R是呈红褐色的菌落数。
- nF是进行产氨测试的显荧光菌落数。
- cF是产氨阳性的显荧光菌落数。
- nR是进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试的红褐色菌落数。
- cR是产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均呈阳性的红褐色菌落数。

′样品稀释：若样品污染严重，建议对样品进行稀释，如10倍递增稀释：取30ml样液加入至270ml无菌生理盐水中，混匀，以此类推，进行系列稀释。
′报告：结果以 CFU/250ml计。

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实验过程是否也会存在铜绿假单胞菌泊污染呢？

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应助达人

是的，据调查回收桶没有清洗干净，或者回收桶清洗后四周没有控干，挂有水滴等再装水就很容易引起铜绿超标
huangfengmei20(huangfengmei20) 发表:主要是回收桶再次利用引起的吗？

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