柱后衍生-高效液相色谱法测定化妆品中游离甲醛含量

小余儿

2019/07/02
恒心永谱

私聊

化妆品检测

一、范围
化妆品目前已成为大多数人生活中必不可少的一部分，它的成分安全也因引起了很大的关注。本方法采用了柱后衍生-高效液相色谱法测定化妆品中游离甲醛含量。本方法适用于水剂、膏霜乳液、凝胶类化妆品中（乌洛托品除外）游离甲醛含量的测定。
二、方法提要

样品中的游离甲醛经高效液相色谱分离，柱后衍生，在420nm波长下检测，根据保留时间定性，峰面积来进行定量，用标准曲线法计算含量。取0.2g 样品时，按照此方法对游离甲醛的检出浓度为0.003%，最低定量浓度为0.005%。
三、试剂和材料
所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T6682 规定的一级水。
1.甲醛标准物质水溶液，使用前要进行标定（标定要用到的的硫代硫酸钠标准溶液需提前两周配置）。
2.磷酸
3.乙酸铵
4.冰乙酸
5.乙酰丙酮
6.二氯甲烷
7.磷酸溶液：在容量瓶中加入998mL水，移取2mL磷酸缓缓加入水中，混匀。
8.柱后衍生溶液：称取62.5g乙酸铵放入容量瓶中，移取7.5mL冰乙酸和5mL乙酰丙酮到容量瓶中，加水至1000mL定容，摇匀。在25℃密封避光保存，该溶液有效使用期3天。
9.甲醛系列标准溶液：用移液枪精密量取甲醛标准物质水溶液适量，用磷酸溶液稀释成 1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL 的标准系列溶液。现用现配。
四、仪器和设备
1.高效液相色谱仪，具有二极管阵列检测器。

2. 柱后衍生仪。

3.天平。

4.离心机。
5.涡旋振荡器
五、分析步骤
1、样品前处理
称取样品0.2g（精确至0.001g）放入10mL具塞比色管中，加磷酸溶液至刻度，涡旋处理1分钟，在5000转/分的速度下离心5min，提取上清液，经过0.45μm微孔滤膜过滤，滤液作为待测溶液，并尽快测定。
甲醛标准物质水溶液标定：
⑴、试剂和材料
所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T6682规定的一级水。
1硫酸
2氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠4g置容量瓶中，用少量水溶解，再加水至100mL定容，混匀。
3 硫酸溶液①：移取硫3mL硫酸，缓慢加入到有97mL水的容量瓶中，混匀。
4 硫酸溶液②：移取10mL硫酸，缓慢加入到90mL水的容量瓶中，混匀。
5 淀粉溶液：称取可溶性淀粉1g，加入5mL水调成溶液后，加入95mL沸水，煮沸，后加入氯化锌0.4g防腐。
6 碘标准溶液：称取碘13.0g和碘化钾35g放入大烧杯中，加入100mL水，溶解后滴入3滴盐酸，用水稀释至1L，过滤后转移至棕色瓶中。
7 重铬酸钾标准溶液：准确称取在120℃干燥到恒重的重铬酸钾基准物质4.9031g与大烧杯中，加水溶解后，转移至1L容量瓶中定容，摇匀。
8 硫代硫酸钠标准溶液：称取硫代硫酸钠26g放入有1L新煮沸放冷的水的烧杯中溶解，加入0.4g氢氧化钠，摇匀，转移到棕色玻璃瓶内储存起来，放置两周后过滤。过滤后进行标定浓度：准确量取重铬酸钾标准溶液25.00mL放入500mL碘量瓶中，加入2.0g碘化钾和20mL硫酸溶液②后，立即密塞，摇匀，于暗处放置10min。再加入150mL水，用硫代硫酸钠溶液滴定至溶液显浅黄色时，加入2mL淀粉溶液，继续滴定至溶液颜色由蓝色变为亮绿色。同时做空白试验。并且计算硫代硫酸钠溶液的浓度：
c(Na2S2O3)=c(K2Cr2O7)×25.00/（V1-V0）
式中：c(Na2S2O3)——硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L；
c(K2Cr2O7)——重铬酸钾标准溶液的浓度，mol/L；
V1——滴定重铬酸钾消耗硫代硫酸钠溶液的体积，mL；
V0——滴定空白消耗硫代硫酸钠溶液的体积，mL。
⑵、标定
准确量取甲醛标准物质水溶液适量（相当于甲醛10～20mg）于250mL碘量瓶中，加入50.00mL碘标准溶液，5mL氢氧化钠溶液，加塞，摇匀放置15min，再加入20mL硫酸溶液①，立即塞紧，混匀，于暗处放置15min，用硫代硫酸钠标准溶液滴定至溶液显淡黄色时，加入2mL淀粉溶液，继续滴定至溶液的蓝色刚好褪去，记录消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积。同时做空白试验。并计算甲醛的浓度：
ρ（HCHO）=（V0-V1）×c×15×1000/V
式中：ρ（HCHO）——甲醛溶液的浓度分数，mg/L；
V——甲醛标准储备液取样体积，mL；
V0——滴定空白溶液消耗的硫代硫酸钠标准溶液体积，mL；
V1——滴定甲醛溶液消耗的硫代硫酸钠标准溶液体积，mL；
c——硫代硫酸钠溶液的摩尔浓度，mol/L；
15——甲醛（1/2HCHO）摩尔质量，g/mol。
2、色谱参考条件
色谱柱：C18 色谱柱（250×4.6mm×5μm）；
流动相：磷酸溶液；
流速：1.0mL/min；
柱温：20℃；
检测波长：420nm；
进样体积：10μL；
柱后衍生溶液流速：0.5mL/min；
衍生温度：100℃。
3、测定
在上述色谱条件下，取甲醛系列标准溶液各10μL分别进样，进行液相色谱分析，以系列标准溶液浓度为横坐标，甲醛衍生物的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，方程为Y=77.47X+34.89，相关系数为0.9999。
取处理得到的待测溶液进样10μL，进行色谱分析，根据保留时间和光谱图定性，测得甲醛衍生物的峰面积，根据标准曲线得到待测溶液中游离甲醛的质量浓度。最后计算样品中游离甲醛的含量。若样品中游离甲醛含量超过0.05%时，可采用液相色谱-三重四级杆质谱进行确证。若样品游离甲醛含量未超过0.05%，则不需要这一步。
六、分析结果的表述
1、计算

式中：ω（游离甲醛）——化妆品中游离甲醛的含量，%；
m——样品取样量，g；
ρ——代入标准曲线计算得到的样品中甲醛的质量浓度，μg/mL；
V——定容体积，mL。
在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值均不超过算术平均值的 5%。
2、回收率和精密度

回收率为97.1% ～ 104.8%，相对标准偏差均小于3%。
七、图谱

图-1.甲醛标准溶液色谱图
甲醛（4.542min）
八、样品确证

1、样品处理
称取样品0.2g（精确至0.001g）于10mL具塞比色管中，加五氟苯肼溶液（称取五氟苯肼1.0g，放入1000mL容量瓶中，用磷酸溶液溶解并定容，摇匀。）至刻度，涡旋处理1分钟，5000rpm 离心5min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液作为待测溶液，立即测定。另取甲醛标准溶液（与样品中游离甲醛的量相当）于10mL 具塞比色管中，同法处理。
2 、液相色谱-质谱法参考条件
色谱参考条件：
色谱柱：C18柱（2.1mm×150mm×3.5μm）；
流动相A：水；
流动相B：乙腈；
流动相梯度洗脱程序如下表：
表 1 流动相梯度洗脱程序

时间/min V（流动相 A）/ V（流动相 B）/
1.0 90 10
3.0 40 60
6.0 0 100
8.0 0 100
8.1 90 10
流速：0.3mL/min；
柱温：25℃；
进样量：5μL。
质谱参考条件：
离子源：电喷雾离子源（ESI 源）；
监测模式：负离子多反应监测模式；
气流温度：160℃；
鞘气温度：350℃；
雾化气压力：30psi；
毛细管电压：1500V；
碰撞气：氮气；
表 2 监测离子对及相关电压参数设定表

物质名称母离子（m/z）子离子（m/z） CE（V）
甲醛与五氟苯肼衍生物 209 189 5
167 17
3 、定性
分别取甲醛标准溶液及样品溶液 5μL，在相同试验条件下，样品中各离子对的保留时间应与标准溶液中各离子对的保留时间一致；样品色谱图中所选择的监测离子对的相对丰度比与标准溶液的离子对相对丰度比的偏差不超过下表规定范围，则可以判断样品中存在甲醛。
表 3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

相对离子丰度（k） k≥50% 50 %> k ≥
20 % 20 %> k ≥
10 % k≤ 10 %
允许的最大偏差 ±20% ±25% ±30% ±50%

4 图谱

图1.甲醛与五氟苯肼衍生物LC-MS色谱图