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HPLC测定不同来源山药中腺苷和脱氢表雄酮的含量

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2019/07/03
河南科高中标检测技术团队

私聊

液相色谱（LC）

HPLC测定不同来源山药中腺苷和脱氢表雄酮的含量

山药(Dioscoreae Rhizoma)是薯蓣科植物薯蓣(Dioscorea opposita Thunb.)的干燥块茎，具有补脾养胃、生津益肺、补肾涩精的功能，是国家卫生部公布的药食两用的中药。然而在2015版《中国药典》一部中只收载了性状、鉴别、检查和浸出物等项目，缺少含量测定项指标，不足以对山药质量进行全面有效的控制。DHEA是人体肾上腺素的一种，国内外研究已经证实，DHEA对预防和治疗心血管疾病、增强免疫力、延缓衰老等均有一定效果，是山药中的重要活性成分之一。另外，腺苷具有舒张血管、降低血压、减慢心律、抑制血小板聚集、松弛血管平滑肌等生理活性。
长期以来，由于对山药品种的评价和改良工作进展缓慢，目前仍然存在山药种植品种杂乱，缺乏综合性优良的品种。因此，本研究对包括野生山药在内的不同来源山药中的腺苷、DHEA含量进行测定，旨在为山药质量标准建立提供参考依据，也为山药品种驯化和选育提供一定的研究基础。
1 仪器和试药
LC-20AD高效液相色谱仪，配备紫外可见检测器(日本，岛津公司)；ME204电子天平(德国Mettler Toledo公司)，KQ-E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
脱氢表雄酮标准品(阿拉丁，批号为H1408213)，腺苷标准品(中国食品药品检定研究院，批号为110879-200202)；甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。山药样品采自河南省温县山药种植基地。
2 方法与结果
2.1标准储备溶液的制备
精密称取腺苷对照品6.61 mg置25 mL容量瓶中，加15 %甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为264.40 μg·mL^-¹的腺苷标准品储备溶液。精密称取DHEA对照品7.62 mg置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为152.40 μg·mL^-¹的DHEA标准品储备溶液。
2.2样品的处理
2.2.1 腺苷样品的处理
取本品粉末(过3号筛)约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入15％甲醇l0 mL，密塞，摇匀，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用15％甲醇补足减失的重量，12000 r·min^-¹离心15 min，取上清液，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.2.2 DHEA样品的处理
取本品粉末(过3号筛)约3.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇l5 mL，密塞，摇匀，称定质量，超声处理1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.3 色谱条件
2.3.1 腺苷色谱条件：色谱柱：Aglient Extend XDB C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：磷酸盐缓冲液(pH6.5) -甲醇(94:6，v/v)；流速：1 mL·min^-¹；柱温：30 °C；检测波长：260 nm；进样量：10 μL。HPLC图见图1。

2.3.2 DHEA色谱条件：色谱柱：Welch Ultimate XB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(62:38，v/v)；流速：0.6 mL·min^-¹；柱温：30 °C；检测波长：204 nm；进样量：10 μL。HPLC图见图2。

2.4标准曲线的绘制
精密吸取腺苷标准品储备溶液0.5，1，3，5，8，10 mL分别置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，按上述色谱条件进样，以峰面积值 Y为纵坐标，腺苷浓度X为横坐标绘制标准方程为：Y=34197.2 X+25515.1，r=0.9999，表明腺苷在13.22 ~ 264.40 μg·mL^-¹浓度内与峰面积线性关系良好。
精密吸取DHEA标准品储备溶液1 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得15.24 μg·mL^-¹的DHEA使用溶液。分别精密吸取DHEA使用溶液0.5，1，3，5，8，10 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，按上述色谱条件进样，以峰面积值 Y为纵坐标，DHEA浓度X为横坐标绘制标准方程为：Y=13042.7 X-1836.3，r=0.9999，表明DHEA在0.76 ~ 15.24 μg·mL^-¹浓度内与峰面积线性关系良好。
2.5 重复性试验
取同一供试品粉末6份，精密称定，按“2.2”项下方法处理，按“2.3”项下色谱条件测定峰面积。结果腺苷和DHEA峰面积的RSD分别为1.87 %和1.91 % (n=6)，表明方法重复性良好。
2.6 精密度试验
精密吸取同一供试品溶液10 μL，按上述色谱条件连续进样6次，测定腺苷、DHEA峰面积值，其RSD分别为0.92 %和1.03 % (n=6)，表明仪器及进样精密度良好。
2.7 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液，室温放置，分别在0，2，4，8，12，24，48 h进样分析。测定腺苷、DHEA峰面积值，其RSD分别为2.07 %和1.65 % (n=6)，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。
2.8 回收率
分别称取已知含量的样品6份，精密称定，分别加入相当含量的腺苷和DHEA对照品溶液，按“2.2”项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别进行测定，计算回收率。结果腺苷、DHEA平均加样回收率为98.10 % (RSD=1.40 %)和97.72 % (RSD=1.15 %)，结果见表1、2。

表1 山药样品中腺苷的加样回收率实验结果(n=6)

取样量/g	样品中量/mg	添加量/mg	测得量/mg	回收率/%	平均回收率/%	RSD/%
0.5014	0.1604	0.1586	0.3141	96.88	98.10	1.40
0.5011	0.1604	0.1586	0.3201	100.72
0.4989	0.1596	0.1586	0.3147	97.76
0.4997	0.1599	0.1586	0.3141	97.22
0.5001	0.1600	0.1586	0.3159	98.28
0.5012	0.1604	0.1586	0.3154	97.74

表2 山药样品中DHEA的加样回收率实验结果(n=6)

取样量/g	样品中量/mg	添加量/mg	测得量/mg	回收率/%	平均回收率/%	RSD/%
1.5013	0.0293	0.0305	0.0589	97.13	97.72	1.15
1.5024	0.0293	0.0305	0.0591	97.72
1.4997	0.0292	0.0305	0.0597	99.86
1.5001	0.0293	0.0305	0.0589	97.21
1.4987	0.0292	0.0305	0.0587	96.64
1.5011	0.0293	0.0305	0.0591	97.80

2.9 结果分析
精密称取不同来源的山药粉末，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样，记录峰面积积分值，外标法计算腺苷及DHEA的含量。结果如下表3所示。

表3 不同来源山药药材中腺苷及DHEA的含量(n=3)

编号	样品来源	腺苷含量/%	DHEA含量/mg/kg
1	种植铁棍山药	0.032	19.50
2	野生山药1	0.027	5.38
3	野生山药2	0.024	3.29
4	驯化野生山药雌株	0.037	24.05
5	驯化野生山药雄株	0.040	62.25
6	紫山药	ND	ND

从测定结果看，不同来源山药中腺苷和DHEA含量差别较大，可能由于品种及生长环境的差异造成。研究表明，驯化野生山药雄株中腺苷和DHEA含量最高，显著高于野生山药中的含量，说明驯化过程对野生山药的改良起到了很好的积极作用。另外，驯化野生山药雄株中DHEA含量比公认的营养成分较高的铁棍山药高出3倍左右，进一步说明该山药品质的优异性。
另外，紫山药中并未检测到腺苷和DHEA两种成分的存在，这可能由于紫山药自身品种差异有关。
3 小结和讨论
3.1 DHEA提取条件优化
在DHEA测定前处理时，本实验曾根据李军等人的优化方法，采用甲醇-丙酮(6:4)超声提取、水浴蒸干、二氯甲烷多次萃取等主要工序对山药中DHEA进行提取，该方法提取效果较好，DHEA可以被较好的富集和检测。但是由于提取过程复杂，实验重复性和加样回收率较难控制。本实验采用甲醇、乙醇、甲醇-丙酮(1:1，v/v)等溶剂对山药样品进行超声1h提取，结果发现，四种溶剂提取效果没有明显差异，因此选用甲醇做为最终提取溶剂。
本实验采用的方法大大简化了山药中DHEA的提取过程，减少了有毒试剂的使用，缩短了提取时间，且提取率与李军的方法相比没有显著的差异。
3.2 小结
本研究对山药中腺苷和DHEA成分的提取和测定条件进行优化，为山药质量标准建立和质量评价提供参考依据。另外，研究对包括野生、种植、驯化品种等不同来源山药中腺苷和DHEA指标含量进行测定，为山药品种的选育和驯化提供一定的研究基础。