乳铁蛋白(Lactoferrin)是乳清蛋白的主要成分之一,广泛分布在人和哺乳动物的乳汁中,是母乳中的核心免疫蛋白,能够帮助婴幼儿提高免疫力,促进婴幼儿的生长发育。因此,添加乳铁蛋白的婴幼儿奶粉越来越受到消费者的青睐,食品安全国家标准-食品营养强化剂-乳铁蛋白(GB1903.17—2016)也将乳铁蛋白列为营养强化剂之中,但该标准中的检测方法未经前处理,检测方法受杂质干扰大。我们自制的SelectCore Heparin肝素亲和SPE柱,可以快速高效的检测乳铁蛋白含量。
适用范围该方法适用于测定婴幼儿配方奶粉、婴幼儿配方米粉、调制奶粉、发酵乳等食品中乳铁蛋白含量。
实验步骤
1、试剂准备
磷酸氢二钠溶液(0.2 mol/L):称取14.2 g磷酸氢二钠,加水溶解,用磷酸调节pH值至8.00±0.50,加水定容至500 mL。
磷酸氢二钠-氯化钠溶液:称取0.71 g磷酸氢二钠,5.84 g氯化钠,用磷酸调节pH值至8.00±0.50,加水定容至100 mL。
乳铁蛋白标准品:乳铁蛋白母液,浓度10 mg/mL,称取1 g乳铁蛋白加水溶解,定容至100 mL。
2、样品制备
液体试样:准确称取5 g试样于50mL离心管中,加入5 mL磷酸氢二钠溶液,涡旋震荡0.5 min,4 °C下以10000 r/min的转速离心10 min,将上清液转移到另一50 mL离心管中。再加入5 mL磷酸氢二钠溶液重复一次,合并两次上清液备用。
固体试样:准确称取1 g试样于50 mL烧杯中,加入5 mL温热的磷酸氢二钠溶液(温度不超过50 °C),搅拌使样品完全溶解,将样品全部转入50 mL离心管中。再向原烧杯加入5 mL磷酸氢二钠溶液,合并两次液体,涡旋震荡0.5 min,4 °C下以10000 r/min的转速离心10 min,将上清液转移到另一50 mL离心管中。再加入5 mL磷酸氢二钠溶液重复一次,合并两次上清液备用。
3、净化
SPE柱活化:SelectCore Heparin,规格1mL小柱加入5 mL磷酸氢二钠溶液活化;
上样:加入步骤2中制备好的上清液;
淋洗:待上清液完全流出后,再用10 mL磷酸氢二钠溶液淋洗,弃去全部淋洗液;
洗脱:用2.5 mL磷酸氢二钠-氯化钠溶液洗脱,收集全部洗脱液,用磷酸氢二钠-氯化钠溶液定容至2.5 mL。将收集溶液过滤膜,供液相色谱分析。
4、液相色谱仪器条件
色谱柱:ChromCore C4-T,5μm,300A,250mm×4.6mm
检测波长:280nm
柱温:30 °C
进样体积:20 μL
流速:1.0 mL/min
流动相:A相:0.1%三氟乙酸水溶液;B相:乙腈
洗脱梯度:
时间(min) | 流速(mL/min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 1.000 | 70 | 30 |
15 | 1.000 | 40 | 60 |
16 | 1.000 | 70 | 30 |
26 | 1.000 | 70 | 30 |
图1 婴幼儿奶粉未经净化和净化后的色谱对比图
图1显示,未经净化处理的婴幼儿奶粉受基质效应影响较大,并且目标峰和杂质峰的分离度较差,净化处理的婴幼儿奶粉基线稳定,并且目标物质清晰可见。
实验谱图及加标回收率数据
实验谱图:
图2 0.2mg/mL乳铁蛋白标准品色谱图
图3 婴幼儿奶粉加标(加标量:10mg/100g)色谱图
图4 婴幼儿奶粉加标(加标量:50mg/100g)色谱图
加标回收率数据:
加标量 | 加标回收率 |
10mg/100g | 85.30% |
50mg/100g | 95.61% |
由以上谱图可以看出,婴幼儿奶粉的加标回收率较好,符合检测要求。
实验讨论
1. 相比市面上常见的琼脂糖基质的肝素亲和小柱,纳谱分析采用单分散聚丙烯酸酯基质开发的肝素亲和小柱滴速更快,相同装量下滴速可以快1~2倍,加快了前处理的时间;
2. 试验操作的时候,即使小柱流干也无需担忧,我们采用的单分散聚丙烯酸酯基质,机械强度高、化学稳定性好,即使小柱流干再次润湿也同样保证回收率。
小柱状态 | 加标量 | 加标回收率 |
未流干 | 1.0 mg/mL | 95.33% |
流干后,再次润湿 | 1.0 mg/mL | 94.20% |