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记一次HILIC色谱柱堵塞再生

歪果仁zZ

2019/09/11
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常用设备综合讨论

记一次HILIC色谱柱堵塞再生
HPLC（高效液相色谱）分析方法作为分离和分析的重要方法被广泛的应用，其中，色谱柱自身特性的优劣直接影响着分离方法的好坏，各类具有特色的填料色谱柱如雨后春笋般的出现。而在色谱柱的日常使用过程中，大多数分析工作者并没有及时清洗色谱柱，这里为大家分享一次HILIC色谱柱堵塞再生过程和色谱柱的一些基本知识。共同学习。
由于在生物样本方法开发过程需要探索血浆蛋白沉淀的体积，弱甲醇/乙腈体积小了，自然溶剂中的基质含量会大大增加，蛋白沉淀的效率也受到影响。而当这样的样品被液相色谱进入色谱柱后，色谱柱极易出现压力变高，即色谱柱堵塞的现象发生。因此在实验完成后，样品被提交至分析系统后，还需经常关注色谱柱及液相色谱系统的压力。
当遇到色谱柱及液相色谱系统压力升高时，先排查堵塞位置。将色谱柱取下接两通，看压力是否恢复正常，若压力为色谱系统的正常压力，则堵塞点为色谱柱；若压力依然很高，堵塞点是色谱系统，继续在通液的情况下，从后到前将管线逐渐拧下，如果去除某一段组件后压力恢复正常，即证明堵塞点为该组件。（从检测器出口排液处->检测器入口端->两通->自动进样器出口端->进样器入口端->泵）。见下图。

当判断为色谱柱堵塞后，还有可能得情况是盐析导致的压力上涨。解决方法：对于反相色谱柱，一般建议先用高水相小流速冲洗过夜，再使用高有机相冲洗。记忆口诀是“先高水再高有机”。对于正相色谱柱，100%异丙醇的极性和正相洗脱能力足够把正相柱上的所有残留物洗掉，更换溶剂时需要注意溶剂间的互溶情况，尤其是水，会较大的干扰正相检测。对于离子交换色谱柱，阳离子色谱柱需要使用酸性缓冲盐溶液冲洗，阴离子色谱柱需要用稀碱缓冲液冲洗，NH2色谱柱，需要先用80%的乙腈（用氨水调节pH至11）冲洗2小时，使在酸性条件下产生的质子化氨基回到初始状态；再用水、甲醇、乙腈、二氯甲烷等冲洗。
样品由于基质复杂，杂志较多，需要对样品进行更细致的前处理，否则容易堵塞色谱柱，造成柱压升高、峰形变差、寿命缩短等一系列问题。因此需要关注样品前处理，对样品进行高速离心、过滤膜或进行SPE纯化等操作，减少样品对色谱柱的损耗。还需要增加预柱，使用预柱可以有效的保护分析柱，填料相同的预柱比单纯靠筛板的预柱更有效的过滤杂质。还有一个非常重要的是需要避免盐析现象的发生，我们需要提前了解流动相所用的盐与有机相之间的溶解性，确保在梯度条件的有机相最高点不会发生盐析。
这里还为大家分享一下色谱柱的保存方法，对于常规的反相色谱柱，使用间隔为1-2天时，我们应该降低流速并连续通液；在几周的短期保存时，不需要流动相冲洗色谱柱，拧紧两端螺母即可，但使用了强酸强碱的流动相时，需要使用含有相同的有机溶剂组成的中性流动相置换保存；长期保存则使用流动相置换为含50%以上的有机溶剂的溶液；更久的（1年以上）保存，则应使用100%乙腈保存。
对于特殊色谱柱，NH2色谱柱，一个月以内的保存，应使用与所选用流动相组成相同的有机溶剂和水的混合溶剂（不含酸、无机盐）进行置换，不能只用水置换。一个月以上的长期保存，应使用出厂时的溶剂，乙腈置换并保存；SCX柱，短期保存可用含盐的水系流动相保存，长期保存则用出厂流动相纯乙腈保存；PC HILIC则使用水/乙腈=85/15及水/乙腈=10/90在常规流速下各冲洗1小时，在色谱柱内为水/乙腈=10/90的状态进行保存。
回到主题，我们有一根飞诺美的HILIC色谱柱，内径3微米，2毫米的直径。刚买来用的时候用95%乙腈0.2ml流速的压力是60bar，我们用了一段时间发现同样条件变成了150bar，好像是柱子堵了，样品里含盐量特别大。咨询了色谱柱维护工程师后，他建议我们按照下面流程进行冲洗。
使用10倍色谱柱体积的下列溶剂依次进行冲洗:
• 95%水/5%乙腈
• 95% 100mM乙酸铵，pH 5.8/5%乙腈
• 95%水/5%乙腈
• 流动相
第一步是95%水/5%乙腈，目的是用于去除缓冲液。第二步95% 100mM乙酸铵，pH 5.8/5%乙腈，使用乙酸铵和弱酸将不易洗脱的杂志及盐冲洗下来。第三步，95%水/5%乙腈，冲洗乙酸铵。第四步，流动相冲洗。
爱护好我们的色谱柱是保证完美峰形和样品正常分析的前提，感谢仪器信息网为我们提供原创大赛这个平台互相学习！今天的分享到这里结束了，文章有错误还希望各位老师指出修改意见。

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wccd1

第1楼2019/09/14

看图脖子都拧酸了，好费劲！

0

歪果仁zZ

第2楼2019/09/15

应助达人

……不好意思，下次可以用手机看，手机可以横屏
wccd1(wccd1) 发表:看图脖子都拧酸了，好费劲！

0

Ins_55be91df

第3楼2020/09/03

大佬，高比例的水相不会破坏里面的键合相吗？

0

Insp_03a5d80f

第4楼2021/05/26

学习中

0

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