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层析柱的选择
lijing320323
2020/01/16
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中药/天然药检测
选柱子:有玻璃柱和不锈钢柱两种,实验室常用玻璃柱。径高比一般在1:5-10。
根据吸附剂用量(体积)确定柱子大小,一般吸附剂应填充到柱子体积的1/4~1/5。柱子可以分为:加压,常压,减压。
压力可以增加淋洗剂的流动速度,减少产品收集的时间,但是会减低柱子的塔板数。其他条件相同的时候,常压柱是效率最高的,但是时间也最长,比如天然化合物的分离,一个柱子几个月也是有的。
减压柱能够减少硅胶的使用量,感觉能够节省一半甚至更多,但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝结),以及有些比较易分解的东西可能得不到,而且还必须同时使用水泵抽气(很大的噪音,而且时间长)。
加压柱是种比较好的方法,与常压柱类似,只是外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气,双连球或小气泵。特别在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大,不然溶剂走的太快就会减低分离效果。加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。
柱子的尺寸为粗长的最好。柱子越长,相应的塔板数就越高。柱子越,上样后样品的原点就越小(反映在柱子上就是样品层比较薄),这样相对的减小了分离的难度。
无水无氧柱适用于对氧、水敏感,易分解的产品。可以湿柱,也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次,因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解,毕竟要分离的是敏感的物质,小心不为过。因为分离的物质比较敏感,所以接收瓶一定要用可密封的,遵循schlenk操作。至于是加压、常压、减压,随需而定。因为是schlenk操作,所以点板是个问题,如果样品是显色的,恭喜了,不用点板,直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色,只好准备几十个schlenk瓶,一瓶一瓶的点,不过几次之后就知道样品在哪,也就可以省些了。
无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外,很容易是样品分解,特别是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝有碱性、中性和酸性的,选择余地比较大,但比硅胶要贵些。听说有个方法,就是用石英做柱子,然后用HF254做固定相,这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了,没有验证过。
选择吸附剂:200-300目硅胶,称30-70倍于上样量;如果极难分,也可以用100倍量的硅胶。干硅胶的视密度在0.4左右,所以要称40 g硅胶,用烧杯量100 ml也可以。
书中写硅胶量是样品量的30-40倍,具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分Rf在0.2-0.4,杂质相差0.1以上),就可以少用硅胶。
用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话,就不容易流出。这样就会发生,后面的点先出,而前面的点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。
常用吸附剂的种类:氧化铝、硅胶、聚酰胺、硅酸镁、滑石粉、氧化钙(镁)、淀粉、纤维素、蔗糖和活性炭等。
几种常见吸附剂的特性
(1)氧化铝:市售层析用氧化铝有碱性、中性和酸性三类,粒度规格大多为100-150目。
碱性氧化铝(pH9—10):适用于碱性物质(如胺、生物碱)和对酸敏感的样品(如缩醛、糖苷等),也适用于烃类、甾体化合物等中性物质的分离。但这种吸附剂能引起被吸附的醛、酮的缩合。酯和内酯的水解、醇羟基的脱水、乙酰糖的去乙酰化、维生素A和K等的破坏等不良副反应。所以,这些化合物不宜用碱性氧化铝分离。
酸性氧化铝(pH3.5—4.5):适用于酸性物质如有机酸、氨基酸等以及色素和醛类化合物的分离。
中性氧化铝(pH7—7.5):适用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在碱性介质中不稳定的物质如酯、内酯等的分离,也可以用来分离弱的有机酸和碱等。
(2)硅胶:硅胶是硅酸的部分脱水后的产物,其成分是SiO2·xH2O,又叫缩水硅酸。柱色谱用硅胶一般不含粘合剂。
适用范围:非极性和极性化合物,适用于芳香油、萜类、甾体、生物碱、强心甙、蒽醌类、酸性、酚性化合物、磷脂类、脂肪酸、氨基酸,及一系列合成产品如有机金属化合物等。
(3)聚酰胺:色谱用聚酰胺主要又锦纶6(聚己内酰胺)和锦纶66(聚己二酰己二胺)两种,分子量一般在16000~20000,其亲水性和亲脂性均较好,因此既可分离水溶性成份,也可分离脂溶性成分。
可溶于浓盐酸、甲酸及热的乙酸、甲酰胺和二甲基甲酰胺中;微溶于乙酸和苯酚等;不溶于醇、氯仿、丙酮、乙醚、苯等;对碱稳定,对强酸可水解。
聚酰胺色谱的原理:兼具吸附色谱和分配色谱的功能。采用强极性洗脱剂时主要为吸附色谱——正相色谱;采用弱极性洗脱剂时主要为分配色谱——反相色谱。
分离对象:能与聚酰胺形成氢键的化合物,如酚类、酸类、醌类、硝基化合物及含羟基、氨基、亚氨基的化合物及腈和醛等类化合物。
聚酰胺在水中吸附能力的规律:
形成氢键的基团(如酚经基、按基、酪基、硝基等)越多,吸附力越强。如丁二酸>丁酸 形成氢键的位置与吸附力有很大关系。对位、间位酚羟基使吸附力增大,邻位使吸附力减小。芳香核、共轭双键多者吸附力大,少者吸附力小。若形成分子内氢键,则使化合物的吸附力减小。
(4)硅酸镁:中性硅酸镁的吸附特性介于氧化铝和硅胶之间,主要用于分离甾体化合物和某些糖类衍生物。为了得到中性硅酸镁,用前先用稀盐酸,然后用醋酸洗涤,最后用甲醇和蒸馏水彻底洗涤至中性。
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