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三招教你利用缓冲盐解决色谱难题
歪果仁zZ
2020/06/01
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私聊
液相色谱(LC)
三招教你利用缓冲盐解决色谱难题
分析工作者在日常工作中,经常会遇到色谱压力升高的现象,随之而来的是柱效的下降、保留时间的异常和色谱峰拖尾等不良现象。此时我们应该考虑流动相中缓冲盐是否加入不当,缓冲盐的使用可调节流动相的pH值,缓解色谱峰拖尾,而添加量过多或类型不对均会对色谱产生不良影响。我们在实验过程中如果使用到极性柱和氨基柱,更应该注意流动相中缓冲盐的添加量,如果过高,缓冲盐随着流动相内水相的提高而析出,造成的问题是色谱柱堵塞,很难清洗。因此本文为大家分享一下缓冲盐的使用经验,希望可以帮助大家顺利开展分析实验。
首先我们明确在流动相中添加缓冲盐的目的:
1.
添加缓冲盐控制流动相pH值,有稳定缓冲的作用;2.对峰型起到改善作用,可以改变出峰时间,峰型前沿和拖尾,分离度各个因素。柠檬酸也是一种缓冲试剂,有时候也起到稳定剂,具有防腐剂的效果,也可改善峰形,抑制拖尾等。一般要根据化合物的结构来确定。例如有羧基的话一般加0.05%或0.1%的三氟乙酸,有碱性基团的话一般加0.05%的三乙胺。在质谱检测器的色谱方法中,一般用挥发性缓冲盐,例如甲酸铵、乙酸铵等,而在流动相中一般把酸性试剂和对应的缓冲盐一起添加,如流动相中有甲酸,一般添加甲酸铵缓冲盐。
我们在使用缓冲盐的时候要注意缓冲盐溶液的过期时间,一般两个月后的溶液需要重新配置,因为其挥发性。我们经过精密仪器称量和溶液配制后,在校准后的pH计上得到了不同浓度缓冲盐的pH值,希望可以帮到大家顺利解决分析难题。5mM FANH4溶液的pH=5.8;5mMFANH4+0.1%FA溶液的pH=2.9;5mMFANH4+0.01%FA溶液的pH=3.85;10mM AcNH4溶液的pH=6.65;5mM AcNH4溶液的pH=6.59。
如果出现柱压升高,我们应该考虑是否缓冲盐使用不当,使得缓冲盐析出,堵塞塞板和键合相颗粒之间的孔隙,阻碍流动相传质,引起柱压升高。如果出现相同化合物的保留时间发生变化,我们也应该考虑是否缓冲盐使用不当造成的影响。而柱效下降,一般是有些缓冲盐会渗入到键合相的深处,损害硅胶基体,导致色谱柱键合相流失,柱床变松,柱效下降;ii)凝结在键合相表面,使C18碳链难以舒展,对物质的保留能力下降,导致柱效下降。因此
液相色谱仪
用过缓冲盐后需要对色谱柱进行冲洗,水中缓冲盐浓度较大时应特别引起注意。
因此在缓冲盐的流动相中使用前和使用后的处理都是有讲究的哦!
使用前的处理:在使用缓冲盐作流动相之前需要用不含缓冲盐的流动相冲洗色谱柱,直至基线平稳。原则上,用于冲洗的流动相与分析时所用的流动相含水的比例相同(或含水更多),不同的只是用于冲洗用的流动相中不含缓冲盐。理由:缓冲盐通常易溶于水,难溶于有机溶剂。用含缓冲盐的(特别是做流动相的水为饱和的缓冲盐溶液时)流动相进行分析时,如果
液相色谱仪
分析前色谱柱中用于保存色谱柱的流动相中含水的比例相对较小,不先冲洗掉,接下来做样品的时候所用的流动相中如果有机溶剂含量大,而其比例中所含的水又不足以溶解该缓冲盐时,缓冲盐将会在色谱柱柱体上析出,沉积下来,这将可能导致上述对色谱柱的损害. .用与分析时含水比例相同的流动相(与分析用流动相唯一的区别是,用于冲洗的流动相不含缓冲盐)进行冲洗约30min,直至基线平稳。如果该
液相色谱仪
的色谱柱在接下来很长的一段时间内不使用,要长期保存,则需再加上一步,即用纯的有机溶剂冲洗一遍,直至基线平稳。缓冲液可以提供离子平衡的反离子,并使流动相保持一定的离子强度和ph值,减少拖尾。
使用后的处理:用与分析时含水比例相同的流动相(与分析用流动相唯一的区别是,用于冲洗的流动 相不含缓冲盐)进行冲洗约30min,直至基线平稳。如果该色谱柱在接下来很长的一段时间内不使用,要长期保存,则需再加上一步,即用纯的有机溶剂冲洗一遍,直至基线平稳。
另外还需要注意:避免使用盐酸盐,盐酸盐对钢质有腐蚀作用。缓冲液最好要现配现用,往往缓冲液是良好的菌类培养液,隔天或放置长时间实验时会有很多怪现象发生。实验后
液相色谱仪
不可用有机溶剂直接过度,有机溶剂会处使盐类析出,造成液路或色谱柱堵塞,可用95:5的水甲醇冲洗。使用缓冲液要及时掌握ph范围,做到胸中有数。清洗液路和柱子时,有温控可加热到30摄氏度易于冲洗。长时间用缓冲溶液要注意观察接头处有无析出,若有白色盐类析出,可考虑一定周期用10%硝酸冲洗一下液路(拆下柱子,走30ml,再用5倍水冲洗)可以避免液路的堵塞。选择缓冲液要用可靠的试剂,避免不纯的盐类造成不必要的麻烦。
如果流动相中有机溶剂的比例很高是不能用来冲洗缓冲盐的,是洗不出来的。通常C18柱先用5%-10%的甲醇冲洗,是可以把缓冲盐冲洗出来的,然后用纯的有机溶剂来保护柱子。最好的方法是使用与流动相相同浓度不含盐的流动相进行清洗。但就是速度慢一些。用水是为了快速替换,一般在15分钟以内最好,且用0.8的流速较好.如果用纯水冲,容易造成键合的碳链流失,最好用5%-10%甲醇水溶液冲. 可以用纯水代替流动相中的缓冲液,有机相不变,这样冲洗柱子比较稳妥。
今天的分享到此结束,感谢仪器信息网提供原创大赛平台让大家互相学习!
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私聊
有水有渝
第1楼
2020/06/01
应助达人
楼主要是能通过小标题似的首先、其次、再次来明确出三招是啥就更好了
1
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