鸡肉中的β-受体激动剂的检测

qiyiguojingjing

2021/06/04

私聊

兽药/抗生素检测

β-受体激动剂是一类人工合成的肾上腺激动剂，俗称“瘦肉精”，在动物体内会提高其瘦肉率，但使用含有瘦肉精的肉类，将对人体造成极大伤害。我国相关法律法规规定禁止在生猪等食源性动物养殖过程中使用β-受体激动剂类药物。

β-受体激动剂是一类化学合成的苯乙醇胺类衍生物，根据苯环上取代基的差异，可分为苯胺型和苯酚型。苯胺结构的化合物，轭合反应率和蛋白结合率低；苯酚结构的化合物轭合代谢过程较强，药物进入人或动物体内后，通过糖苷键结合参与代谢，转换为葡萄糖醛酸轭合物或硫酸轭合物。所以β-受体激动剂的检测通常需要酶水解步骤，β-葡萄糖醛酸酶是一种可以使葡糖醛酸苷键加水分解的酶，它可以把葡萄糖醛酸轭合物或硫酸轭合物的糖苷键切断，释放出游离态。

目前，检测β-受体激动剂通常参照GB-T22286-2008方法，具体检测流程为：称量2g样品 — 加50μl酶水解12小时 - 添加内标物 - 振荡提取15min - 离心10min（5000r/min） - 移取4mL上清液加入0.1mol/L高氯酸溶液5mL，混合均匀 - 高氯酸调节PH值至1±0.3 - 离心10min（5000r/min） - 移取全部上清液至新的离心管中，用10mol/L的氢氧化钠溶液调PH至11 - 加入10 mL饱和氯化钠溶液和10 mL异丙醇-乙酸乙酯（6: 4）混合溶液，充分提取 - 离心10min（5000r/min）- 取全部有机液氮气吹干 - 加5 mL乙酸钠缓冲液（pH 5.2）复溶残渣 - 净化样品 - UPLC-MS/MS检测。

在β-受体激动剂检测过程中，酶水解是检测中的关键步骤之一，然而12小时的酶水解时间严重影响了工作效率，所以选择一种合适的酶，提高水解效率是需要解决的问题。目前，市场上的β-葡萄糖醛酸酶一般提取自鲍鱼，蜗牛，大肠杆菌，还有IMCSzyme®生物工程改良的β-葡萄糖醛酸酶，相较其他同类产品，IMCSzyme®活性、纯度得到显著提高。 IMCSzyme® 不仅能缩短酶解反应时间、简化后期纯化步骤，其高纯度也大大降低了对检测仪器的干扰和损害。下面我们就用实验来验证IMCSzyme®β-葡萄糖醛酸酶的性能。

参照GB-T22286-2008方法，做IMCSzyme® β-葡萄糖醛酸酶与蜗牛β-葡萄糖醛酸酶对比实验。分别取沙丁胺醇和特布他林阳性鸡肉样品2 g，加入0.2 mol/L乙酸钠缓冲液(pH 5.2) 8 mL，蜗牛β-葡萄糖醛酸酶50 μL，37 ℃放置12 h；另取沙丁胺醇和特布他林阳性鸡肉样品各2 g，加入快速水解缓冲液(pH 7.4) 8 mL，IMCSzyme® β-葡萄糖醛酸酶50 μL，37 ℃放置12 h；酶解反应后，样品前处理并净化，最后UPLC-MS/MS检测。结果如图1所示，含沙丁胺醇和特布他林的阳性鸡肉样品经蜗牛β-葡萄糖醛酸酶酶解处理的测定结果分别为8.62 μg/L和9.66 μg/L；经IMCSzyme®水解测定结果分别为10.7 μg/kg和13.17 μg/kg；结果表明，采用相同的酶用量和酶解时间，IMCSzyme®对底物的水解效率高于蜗牛β-葡萄糖醛酸酶。

图1 不同酶制剂水解效率的比较

采用IMCSzyme®β-葡萄糖醛酸酶水解样品，实验设计了2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h水解时间，考察水解效率。实验步骤：分别取含沙丁胺醇和特布他林阳性鸡肉样品2 g，加入快速水解缓冲液(pH 7.4) 8 mL，IMCSzyme® β-葡萄糖醛酸酶50 μL，37 ℃分别放置2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h，酶解反应后，按照GB-T22286-2008方法进行处理并净化，UPLC-MS/MS检测。结果如图2所示，由图表明沙丁胺醇、特布他林水解2h，水解产物逐渐增多；水解2-8h，水解产物变化不大，水解超过8h，水解产物开始降解。由此推断2小时已水解已基本完成。

图2 IMCSzyme®不同时间水解效率对比

综上述实验可得，使用IMCSzyme® β-葡萄糖醛酸酶水解样品只需2小时就能水解完全，这大大的缩短了β-受体激动剂水解时间，提高了检测效率。

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