溶菌酶
赵浩博
溶菌酶又称细胞壁质酶或 N- 乙酰胞壁质聚糖水解酶。1922 年英国细菌学家 A. Fleming 发现人的唾液、 眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶， 因其具有溶菌作用， 故命名为溶菌酶。 此后在人和动物的多种组织、 分泌液， 及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。 随着研究的不断深入， 发现不仅有溶解细菌细胞壁的溶菌酶， 还有作用于真菌细胞壁的种类， 同时对其作用机制也有了更进一步的了解。 近几年， 人们根据溶菌酶的溶菌特性， 将其应用于医疗、 食品、畜牧及生物工程中。
溶菌酶来源不同，其分子大小不一样，其氨基酸排列顺序也有所不同，如： T4 噬菌体溶菌酶由 164 个氨基酸组成，分子量为 19 ku；鸡蛋溶菌酶只有 129 个氨基酸，其分子量约为 14.3 ku；人溶菌酶由 130 个氨基酸残基组成，分子量为 14.6 ku；植物中分离出的溶菌酶，其分子量较大，约为 24 ku~29 ku。各种溶菌酶的等电点在 10.7~11.5 之间，化学性质十分稳定， pH 在1.2~11.3 范围内剧烈变化时，其结构几乎不变，活性不受影响，此外，溶菌酶对热也极为稳定，在 pH3.0 条件下，沸水浴中加热 60 min 其活力仍保持 90 %以上。目前鸡蛋清溶菌酶是研究最清楚的一种溶菌酶并已投入商业化生产。它是由 18 种 129 个氨基酸残基构成的单一肽链，有 4 个 S-S 键的氨基酸 Cys，等电点约为 11.1，最适溶菌温度为 45 ℃~50 ℃， pH 为 6.0~7.0。在酸性环境中，溶菌酶对热的稳定性很强， pH4~7范围内， 100 ℃处理 1 min 仍有近 100 的活力， 210 ℃加热 1.5 h 仍具有活性；在中性水溶液中，溶菌酶可维持数天而不失去活性；在碱性条件下，其稳定性较差。
1. 溶菌酶的理化性质
溶菌酶纯品呈白色、微黄或黄色的结晶体或无定形粉末，无异味，微甜，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚。溶菌酶遇碱易被破坏，但在酸性环境下，溶菌酶对热的稳定性很强，在pH值为4-7时，100℃处理1min，仍能较好地保持活力:pH值为3时，能耐100℃加热处理45min。
溶菌酶化学性质非常稳定，当pH值在一定范围内剧烈变化时，其结构几乎不变。溶菌酶不可逆变性的临界点是77℃，随溶剂的变化，不可逆变性临界点也发生变化，当溶菌酶所处溶液pH值小于1时，不可逆变性临界点降低到43℃。
溶菌酶最适pH为5.3~6.4，可用于低酸性食品防腐；溶菌酶作为防腐剂安全性高，可被冷冻或干燥处理，且活力稳定。
溶菌酶对几种变性剂的敏感程度为:二恶烷>二甲基乙酰胺>二甲基甲酰胺>丙酮，并且随溶剂用量的增加而直线下降。
2. 溶菌酶的制备
目前溶菌酶可以以鸡蛋清和蛋壳膜为材料提取制得，常用的方法有亲和层析法、离子交换树脂法、直接结晶法和聚丙烯酸沉淀法等。
亲和层析法是利用蛋白质和酶的生物学特异性，即蛋白质或酶与其配体之间所具有的专一性亲和力而设计的色谱技术。酶一底物复合物形成之后，在一定的条件下分离复合物便得到纯净的酶。常常使用的吸附剂为几丁质及其衍生物，如：几丁质粉、羧甲基几丁质、几丁质包埋纤维素、脱氨几丁质粉、N-酰化壳聚糖、脱氨再生几丁质凝胶。
离子交换法是利用离子交换剂与溶液中的离子之间所生的交换反应来进行分离的，分离的效果较好，广泛用于微量组分的富集。一般流程为：鲜蛋一预处理一搅拌吸附一上柱洗脱一等电点沉淀一透析一喷雾干燥一成品。
溶菌酶在等电点以下较广泛的pH值范围内，分子带正电荷，可吸附于弱酸性阳离子交换树脂上，洗脱后盐析，可得溶菌酶沉淀，再进行精制可得成品。蛋清吸附724树脂，洗涤缓冲液洗脱，硫酸铵溶液盐析透析，用NaOH去碱性蛋白，冻干溶菌酶，冻干粉沉淀干燥得到溶菌酶。在5—10℃下，将新鲜蛋清540kg加入到已处理好的80kg 724树脂中，搅拌吸附6h，在0—5℃静置过夜。倾出上层蛋清，树脂离心甩干，用蒸馏水反复洗去黏附的卵蛋白，然后将树脂装入柱内，用0.15mol/L、pH=6.5磷酸缓冲溶液约150L洗涤树脂，再用约600L的10%硫酸铵溶液洗脱，收集洗脱液。洗脱液中加硫酸铵，使最终含硫酸铵量为40%，有白色沉淀生成，冷处放置过夜。虹吸上层清液，沉淀吸滤抽干，再用1倍蒸馏水溶解沉淀呈稀糊状，然后装入透析袋，在约5℃的条件下，对蒸馏水透析24h左右，中间换水2—3次。离心去除沉淀，沉淀再用少量水洗一次，洗液与离心液合并。再往透析清液中慢慢加入1mol/L氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH值上升到8.0—9.0，如有白色沉淀，即离心除去。然后用3mol/L盐酸调pH=5.0，冷冻干燥，即得白色片状溶菌酶。也可将离心液用3mol/L盐酸调pH=3.5，在搅拌下缓慢加入5%的固体氯化钠，在约5℃的温度下静置48h，离心，沉淀用0℃丙酮洗涤，干燥，即得溶菌酶。
在蛋清中加入一定量的碘化物或碳酸盐等盐类，并调pH值至9.5—10.0，溶菌酶会以结晶形式慢慢析出，而大多数蛋白质仍然在溶液。在超滤浓缩脱盐后，为获得较纯产品，采用结晶纯化酶液经超滤处理后，用NaOH调整pH 9.5，离心去除。上清液在缓缓搅拌下，加NaCl至5%，静置一周，得粗结晶。结晶溶于pH 4.6醋酸水中，分去不溶物后，进行重结晶，结晶的最终得率为60%左右。即每公斤蛋清中可得重结晶品近1.3 g，活力测定为8000U/mg。
聚丙烯酸沉淀法为将提取过滤后含酶洗脱液，首先经过吸附步骤，即将过滤后的澄清溶液用20%的NaOH溶液调pH至6.0，在调pH值的过程中不停的搅拌。有少量的乳白色沉淀析出，然后加入15%聚丙烯酸，立即有白色沉淀析出，加至pH值为3.0为止，静置17个小时进行静析，得到粘附于底部的乳白色胶状物。第二步解离，将前步得到的溶菌酶聚丙烯酸凝聚物。加入少量蒸馏水并用0.5 mol/L的碳酸钠，将其溶解，转移后，将pH值调到9.5。加入5%CaCl2溶液将溶菌酶聚丙烯酸解离，至无沉淀析出，然后过滤，得到澄清溶液。第三步盐析，将所得澄清溶液加入5%的NaCI溶液搅拌均匀。放入冰箱调温度为0℃。待有晶体析出后，用无水乙醇洗涤数次，置恒温培养箱中40℃条件下干燥称重。
3. 溶菌酶的应用
本文主要从溶菌酶在食品添加剂中的应用展开进行论述。
3.1 用于水产、肉类的防腐
将溶菌酶应用于水产品、肉类的保鲜防腐，目前已做了大量的研究。如早在 2001 年前陈舜胜等就研究了溶菌酶复合保鲜剂在冷藏（5 ℃）与冰藏（0 ℃~1 ℃）条件下对虾、带鱼段、扇贝柱和柔鱼的保鲜效果，结果表明，使用溶菌酶（0.05 %）复合保鲜液浸泡后冷藏或用溶菌酶（0.05 %~0.08 %）复合保鲜液制备保鲜冰冰藏，与常规保鲜方法相比，可将上述水产品的保鲜期延长约一倍的时间。2012 年张观科又报道：采用溶菌酶、Nisin、甘氨酸、VC、山梨酸钾、NaCl 等不同的配比的复合生物保鲜剂在不同温度对牡蛎进行保鲜贮藏研究。结果表明，采用 Nisin 和溶菌酶配合的生物保鲜剂的保鲜效果最佳（在-3 ℃微冻条件下，保藏 30 天后感官性状仍然良好） 。而钱曦利用海藻糖、蜂胶、茶多酚、魔芋葡甘露聚糖、Nisin、溶菌酶、壳聚糖和姜汁 8种天然保鲜剂对鹿肉保鲜进行研究，结果表明：单独使用时，溶菌酶对鹿肉样品就有较明显的抑菌作用（最佳抑菌浓度为 0.5 %）；而采用复合天然保鲜剂（茶多酚、溶菌酶、海藻糖、Nisin 复合）效果更好，可以有效的提高鹿肉的货架期至 36 d。从以上研究结果来看，溶菌酶尤其是它在与其他保鲜剂按一定比例复合使用时，对水产及肉类能起到较好的防腐保鲜效果。
3.2 在低度酒类、饮料中的应用
日本已成功的使用鸡蛋清溶菌酶代替水杨酸作防腐剂用于清酒的防腐。在国内，倪瑛和钟立人研究了溶菌酶在葡萄酒生产中的应用。因为在葡萄酒生产中乳酸菌会将苹果酸转变为乳酸，但如果在酒精发
酵的前期就完成了这种反应，会对葡萄酒的感官产生不良影响，而控制乳酸菌生长的传统方法是使用 SO2，但 SO2 的使用不仅对人体产生毒性，同样影响葡萄酒的品质。因此，倪瑛等尝试将溶菌酶替代或补充 SO2 调控乳酸菌的生长，结果显示，在葡萄原汁中加入 0.1 %~0.15 %的溶菌酶，乳酸菌生长被抑制；在白葡萄酒中溶菌酶剂量加至 0.5 %时，可完全抑制苹果酸向乳酸的转变。此外，将溶菌酶用于饮料防腐也有报道，如常凯等将溶菌酶（0.05 %） 、甘氨酸和 NaCl 进行复配用于生产脱脂山核桃乳，其抑菌效果较显著，降低了山核桃乳的杀菌强度，延长了产品货架期。从以上结果看，在葡萄酒的生产中溶菌酶可作为SO2 天然的、安全的替代或补充品来抑制乳酸菌的生长，在其他低度果酒中也可做类似的尝试；同样将溶菌酶用饮料的防腐也有较显著的效果。
3.3 在乳制品中的应用
由于溶菌酶对肠道中腐败性微生物有特殊的杀灭作用，同时可直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。因此，有大量有关溶菌酶应用于婴幼儿奶粉的专题论述 冯棋琴，等：溶菌酶在食品工业中的研究进展
35研究报道，如刘浩强等研究了鸡蛋溶菌酶对婴幼儿配方奶粉的抑菌效果，结果表明，婴幼儿配方奶粉在喷雾干燥后添加 10 mg/100 mL~50 mg/100 mL 的鸡蛋溶菌酶效果最好。张明江等关于婴幼儿配方奶粉中溶菌酶的添加工艺的研究也得出了相似的结论，既奶粉喷雾干燥后添加 500 mg/L 的溶菌酶抑菌效果最好。
3.4 在水果保鲜上的应用
水果经过溶菌酶处理，其表面的细菌被有效的抑制或杀灭，从而延长水果的保鲜期。胡晓亮等采用溶菌酶与溶菌酶复合保鲜剂对马陆葡萄进行涂膜保鲜，结果表明：溶菌酶单独使用有一定的保鲜效果，但将溶菌酶（0.1 %）和海藻酸钠（1 %）复合使用对抑制马陆葡萄的感官品质下降效果更为显著，在（4±1） ℃条件下贮藏 25 d 后，仍保持果实的硬度和组织形态，质量损失率仅为 9.34 %。
溶菌酶本身作为一种天然蛋白质，能在胃肠内作为营养物质被消化和吸收，对机体无毒性，也不会在体内残留，安全性很高，加之有效的防腐特性，溶菌酶已受到了食品行业的青睐。但目前实际应用的且已商品化的是鸡蛋清溶菌酶，它的抗菌谱较窄，只对 G+细菌起作用，底物特异性强，且投入/效率低，这限制了它们的广泛使用。为了扩大溶菌酶使用领域及防腐效果，可以将鸡蛋清溶菌酶与其他天然保鲜剂（如海藻糖、茶多酚、Nisin、溶菌酶、壳聚糖等）配合使用。
此外，随着科学技术的发展，人们还可以采用一些高科技手段（如采用微生物发酵法生产溶菌酶，采用酶修饰法合成溶菌酶复合物如溶菌酶-环糊精、溶菌酶-半乳甘露聚糖等）生产并改良溶菌酶。经过改良的溶菌酶不仅抗菌活性稳定，而且具有良好的乳化性能。当这些杀菌谱广、成本低、安全性高溶菌酶复合剂以及人工合成溶菌酶商品化时，溶菌酶的使用范围定会越来越广，将会在各行业发挥不可估量的作用。
4. 溶菌酶的限量，检测与标准
溶菌酶可水解细菌的细胞壁, 造成藤黄微球菌的溶解而引起溶液吸光度值的降低。
一个溶菌酶活力单位定义为25 ℃ ,pH 6.2 条件下, 使用藤黄微球菌悬浊液在450 nm 处每分钟引起吸光度变化为0.001 所需溶菌酶的量。
试剂和材料
藤黄微球菌:ATCC4698 或 CICC10680。
0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液:pH 6.2。
称取11.70 g 磷酸二氢钠(NaH2PO4 · 2H2O) 、7.86 g 磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 及0.372 g乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-2Na)于无菌水中并稀释定容至1000mL。调整缓溶液pH至6.2±0.1。
注: 用小份缓冲溶液检查pH, 以避免缓冲溶液被污染。如果需要, 通过加入更多的磷酸二氢钠溶液或磷酸氢二钠溶液调整pH。
溶菌酶标准品: 蛋清溶菌酶。
底物溶液: 用磷酸盐缓冲液制备50 mL 藤黄微球菌悬浊液。 使用前, 底物于37 ℃ 培养30 min。该底物溶液室温下可稳定2 h。 以磷酸盐缓冲液调分光光度计零点, 然后测定底物溶液的吸光度,450 nm 下读数应为0.70±0.1。
仪器和设备
分光光度计: 精度±0.001。pH 计。
注: 所用的器皿应保持无菌, 保证工作环境的清洁。
分析步骤
试样溶液的制备
准确称取100 mg±0.1 mg 试样, 置于50 mL 容量瓶中, 用约25 mL 磷酸盐缓冲液搅拌溶解并稀释定容, 充分混匀。 再转移3 mL 上述试样制备溶液至100 mL 容量瓶中, 用磷酸盐缓冲液搅拌溶解并稀释定容。
标准溶液的制备
精确称取50 mg 蛋清溶菌酶标准品于50 mL 容量瓶中, 用约25 mL 磷酸盐缓冲液搅拌溶解并稀释定容, 充分混匀(如果需要, 冷冻该溶液以备后续测定)。转移3 mL 上述标准制备溶液至100 mL容量
瓶中, 用磷酸盐缓冲液搅拌溶解并稀释定容。测定取3 份标准溶液和3 份试样溶液进行测定。
25 ℃ 室温下, 将1 cm 比色皿放入分光光度计, 用磷酸盐缓冲液调整吸光度零点。 吸2.9 mL 底物溶液于比色皿, 最初450 nm 处吸光度应为0.70±0.10,3 min 之内初始吸光度值变化应小于或等于0.003 时, 方可开始测定。 吸取0.1 mL 标准溶液加入底物溶液, 充分混合。 记录3 min 吸光度值的变化, 每15s 记录一次吸光度值。 每分钟吸光度值变化应在0.03~0.08, 若不在要求范围需调整试样溶液的浓度。 重复操作测定试样溶液。反应1 min 后稳定, 计算时忽略最初1 min 的读数。
结果计算
酶活力 X , 按式计算:
X =(A1 -A2)/(2 × m ×0.001)
式中:
A1 ———试样在450 nm 处反应1 min 时的吸光度;
A2 ———试样在450 nm 处反应3 min 时的吸光度;
m ———用于分析的试样制备溶液中的溶菌酶质量, 单位为毫克(mg) ;
2 ———获得1 min 和3 min 吸光度读数所用的时间, 单位为分钟(min) ;
0.001———由单位溶菌酶每分钟引起的吸光度降低的值。
试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差
值不大于算术平均值的10%。
最终对于溶菌酶的检测要求罗列如下：
注：本标准适用于以鸡蛋清为原料, 经提取、精制等工艺制得的食品添加剂溶菌酶。
溶菌酶作为一种天然球状蛋白质， 能促进营养物质被人体消化吸收， 对人体无毒性， 也不会在体内残留， 是一种安全性很高的食品保鲜剂、 营养保健品和药品。 由于每一类型的溶菌酶都有其最适的作用条件， 而且底物特异性强， 因此， 在应用溶菌酶时， 必需注意以下几个事项： ①充分掌握溶菌酶的酶学特性， 掌握食品中的营养成分、 pH 值、 食盐浓度等影响溶菌酶效果的因素以及造成某种食品腐败的主要微生物群体， 采用适当的添加量和添加方法才能收到应有的防腐效果。 ②为了有效的发挥溶菌酶作用效力， 可以考虑与其它物质配伍使用。 如将溶菌酶与甘氨酸混合使用， 其防腐效果则远远高于单独使用溶菌酶。 因为甘氨酸含量达到一定程度时， 能抑制微生物细胞壁的合成， 这种作用对革兰氏阳性菌和阴性菌均有效， 从而增了溶菌酶效力的发挥。 也可以考虑与植酸、 聚合磷酸盐等配伍使用， 以增强溶菌酶革兰氏阴性细菌的抑菌作用。 不管与哪种物质配伍使用， 使用之前都要进行小试。
参考文献：
[1] GB 1886.257-2016,食品安全国家标准 食品添加剂 溶菌酶.
[2] 范林林, 林楠, 冯叙桥,等. 溶菌酶及其在食品工业中的应用[J]. 食品与发酵工业, 2015, 41(003):248-253.
[3] 冯棋琴, 周立梅, 高文功,等. 溶菌酶在食品工业中的研究进展[J]. 食品研究与开发, 2015, 000(005):134-136
[4] 张新宝, 陈红兵. 溶菌酶的性质及其在食品防腐中的应用[J]. 江西食品工业, 2008(4):42-45
仪器信息网“仪友会”招募令
科学仪器品牌联合“仪器心得”征文活动
【生活中的仪器检测】有奖征文
LC-MS实验瓶颈的突破与优化
