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慢病毒载体转染技术
小小矮马
2022/10/10
小矮马
私聊
生物制药
慢病毒载体感染技术
慢病毒载体感染技术已经被广泛应用于
RNA
干扰技术中。使用慢病毒载体,
shRNA
被导入宿主细胞的细胞核内,根据启动子不同,
shRNA
可被
RNA
聚合酶
II
或者
III
催化转录
,这些前体结构被
加工形成
pre-shRNA
,
随后被
Dicer
和
TRBP/PACT
酶切,去除发卡结构,产生在两个
3
’
末端带有两个游离碱基的
20-25
nt
的双链
siRNA
。这一有活性的
siRNA
随后
与
Argonaute
(Ago)
等蛋白质因子结合,形成
RNA
诱导的沉默复合体
(RNA-induced silencing complex, RISC)
。
作为
RISC
的一部分,
siRNA
通过碱基互补配对以序列特异性的方式结合到靶
mRNA
,
在镁离子和
ATP
的参与下,
Ago
切割靶标
RNA
,产生的
RNA
片段被快速降解,从而在转录后水平沉默靶基因的表达
[63-65]
。
凋亡是多
基因
严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守,如
Bcl-2
家族、
caspase
家族
。内源性细胞凋亡途径始于线粒体,细胞色素
C
从线粒体内释放是关键的一步。在细胞凋亡信号的刺激下,细胞色素
C
从线粒体释放到胞浆,并与凋亡细胞蛋白酶激活因子
Apaf-1
结合,在
dATP
存在下,募集并激活
caspase-9
,形成
Cyto-3-Apaf-1-caspase-9
凋亡体,激活下游的效应蛋白酶,如
caspase-2
、
3
、
6
、
7
、
8
、
9
,启动
caspase
的级联反应,引起细胞凋亡。
caspase
被认为是凋亡的中心实施者,
caspase9
是调控
caspase
,参与打靶与激活调控,激活
caspase3
。
caspase3
处于凋亡级联反应的核心位置,是效应
caspase
,是参与凋亡的效应物。
caspase3
的主要底物是聚合酶
PARP
,在细胞凋亡启动时,
PARP
通过
caspase
的裂解剪切参与凋亡的发生。
cappase-3
对
PARP
的蛋白水解作用是凋亡实施的早期事件或前提条件。
Bcl-2
是一种具有抑制细胞凋亡作用的蛋白,能够抑制
caspase
激活,结合
Apf-1
及
caspase
-9
,并维持其非活化状态,抑制
caspase
级联反应,并且抑制线粒体释放细胞色素
C
,防止细胞凋亡
[78, 79]
。实验中,我们通过
western blot
检测相关蛋白发现,与对照组相比,
cleaved-caspase3
、
cleaved caspase-9
、
cleaved PARP
的表达量增加,而
Bcl-2
抗凋亡蛋白表达量减少,
PARP
表达量明显下降,表明,
MSI1
低表达促进了凋亡的产生。
附件:
6 慢病毒载体感染技术.docx
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