液相色谱法测定血竭中血竭素不确定度的评定与表示
摘要：为了评定液相色谱法测定血竭中血竭素含量的测量不确定度。 建立血竭中血竭素含量的数学模型，分析测量不确定度的来源并对各分量进行量化分析和评估，合成标准测量不确定度，给出扩展测量不确定度报告。血竭中血竭素含量的扩展测量不确定度为0.1%，测量结果表示为(1.8±0.1)%，k=2。分析产生不确定度的主要来源，为有效地控制该含量测定方法的准确性提供可靠的理论依据。
关键词：液相色谱；血竭；测量不确定度；血竭素
Evaluation and expression of measurement uncertainty in determination of dracorhodin in Draconis sanguis by liquid chromatograph
Abstract: To evaluate the measurement uncertainty for the determination of dracorhodin in Draconis sanguis by liquid chromatograph. The mathematical model of determination by HPLC was established. The uncertainty sources had been analyzed. Each active component of uncertainty was calculated, and the expanded uncertainty was obtained. The expanded uncertainty for the HPLC determination of dracorhodin in Draconis sanguis ? was 0.1%, and the result of determination was(1.8±0.1)%, k=2. The main sources of uncertainty are analyzed, which provide the reliable theoretical basis for effectively controlling of this method.
Keywords: liquid chromatograph; Draconis sanguis?? measurement uncertainty; dracorhodin;
本品为棕榈科植物麒麟竭Daemonorops draco Bl.果实渗出的树脂经加工制成，分布于印度尼西亚爪哇、苏门答腊、婆罗洲等处，其中主要成分为血竭素。实验表明，血竭具有活血定痛，化瘀止血，生肌敛疮的功效。用于跌打损伤，心腹瘀痛，外伤出血，疮疡不敛。目前，测定血竭中血竭素主要有液相色谱法，液相色谱质谱联用方法。药典中药材含量测定测量不确定度是表征合理的赋予被测量之值的分散性与测量结果相联系的参数，测量的不确定度是测量可靠性的重要标志，也是国际通用的最基本、最重要的特性指标之一，通过对测量不确定度的合理评定可以定量评价测量结果的质量，并表示出测量的可信程度。本研究按照自下而上的方法结合《测量不确定度评定和表示》中的规定，对HPLC测定血竭中血竭素含量的测量不确定度进行评定，分析影响不确定度的因素，为客观评价血竭中血竭素的含量测定结果提供科学依据，并对分析测试方法进行几点改进，以提高测试。
1仪器与试药
1.1 仪器
LC-20AT液相色谱仪配制紫外检测器（日本岛津）；Zorbax SB C18色谱柱 (250mm*4.6μm*5μm)，Angilent）；ME204电子天平（万分之一，梅特勒）；AUW220D电子天平（十万分之一，日本岛津）。
1.2试药
血竭药材购自药店，经棕榈科植物麒麟竭Daemonorops draco Bl.果实渗出的树脂经加工制成；血竭素高氯酸盐（批号110811-20210，含量≧99.0%）、无水乙醇，分析纯（）。乙腈（色谱级，上海安谱）、磷酸二氢钠、磷酸、甲醇（分析纯，北京北化精细化学品有限责任公司）。
2 方法
2.1 色谱分析条件
LC-20AT液相色谱仪，色谱柱：Zorbax SB C18(250mm*4.6μm*5μm)，流动相：以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钠溶液（50:50）；检测波长为440nm；柱温40℃，进样量：10 μL 。
2.2 溶液制备
2.2.1 对照品溶液的制备
取血竭素高氯酸盐对照品，精密称定10 mg，置50mL棕色量瓶中，加3%磷酸甲醇溶液使溶解，并稀释至刻度，摇匀，（血竭素重量=血竭素高氯酸盐重量/1.377）。
2.2.2 溶液制备
取本品适量，研细，取0.05～0.15g，精密称定，置具塞试管中，精密加入3%磷酸甲醇溶液10ml，密塞，振摇3分钟，滤过，精密量取续滤液1ml，置5ml棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过0.45 μm滤膜即得。
2.3 建立数学模型
根据测定原理和过程，样品的标示百分含量计算公式为：
式中：w---样品中被测成分的含量（%）；C1---标准溶液浓度(μg/mL)；A1---标准溶液峰面积；A2---样品溶液峰面积；V1---样品溶液定容体积(mL)；m---样品的质量（g）；f---稀释倍数。
3不确定度来源分析
根据分析过程的描述及对计算模型分析，测量不确定度来源主要有：（1）测量重复性，（2）样品溶液配制，（3）标准品溶液配制。
图1 不确定度来源鱼骨图
4 各标准不确定度分量的评定
4.1标准品溶液配制引入的不确定度u1
4.1.1 称量标准品带来的不确定度u1.1
4.1.1.1天平检定时产生的偏载误差引入的标准不确定度u(m1)
标准品称量用十万分之一天平，根据天平检定证书，天平偏载误差为0.2 mg，按均匀分布B类评定，k=
则天平偏载误差引入的不确定度为：
u(m1)=0.2mg/
=0.1155 mg
4.1.1.2天平重复性误差产生的误差引人的标准不确定度u(m2)
根据天平检定证书，天平重复性误差为0.2 mg，按均匀分布B类评定，k=
，则天平重复性误差引入的不确定度为：
u(m2)=0.2mg/
=0.1155 mg
4.3.1.3 天平示值误差产生的误差引人的标准不确定度u(m3)
方法中标准品称取5.0 mg，精确至0.00001 g，根据天平检定证书，当称样量不大于5×103 mg时，天平示值误差为0.1mg，按均匀分布B类评定，k=
，则天平示值误差引入的不确定度为：
u(m3)=0.1 mg/
=0.0577 mg
样品称量时每次都需要清零，实际上是一次称样，因此，试样称量引入的合成标准不确定度u3.1为：
u1.1=
=0.1732mg
称取标准样品3次，其平均质量为0.00512 g，则相对标准不确定度urel3.1：
urel1.1=u1.1/m=0.1732 mg/5.12 mg=0.0338
4.1.2标准品定容带来的不确定度u1.2
标准品溶液配制使用的是10 mL容量瓶，检定证书上给出容量瓶检定级别为A级，容量允差为±0.02 mL，该分布为均匀分布，k=
，则容量瓶误差引入的不确定度为：
u1.2=0.02 mL/
=0.0115 mL
容量瓶所引入的相对不确定度 ：
urel1.2= 0.0115 mL /10 mL=0.00115
4.1.3标准品稀释带来的不确定度u1.3
标准品溶液稀释使用的是1 mL移液管，检定证书上给出移液管检定级别为A级，移液管允差为±0.01 mL，该分布为均匀分布，k=
，则容量瓶误差引入的不确定度为：
u1.3=0.01 mL/
=0.0059 mL
移液管所引入的相对不确定度 ：
urel1.3= 0.0059 mL /1 mL=0.0059
根据上述数据，所以配制标准溶液引入的相对不确定度urel1按照下式计算：
urel3=
=0.0069
4.2样品溶液配制引入的不确定度u2
4.2.1 天平计量性能引入的不确定度u2.1
4.2.1.1天平检定时产生的偏载误差引入的标准不确定度
根据天平检定证书，天平偏载误差为0.3 mg，按均匀分布B类评定，k=
则天平偏载误差引入的不确定度为：
u(m1)=0.3mg/
=0.1732 mg
4.2.1.2天平重复性误差产生的误差引人的标准不确定度u(m2)
根据天平检定证书，天平重复性误差为0.1 mg，按均匀分布B类评定，k=
，则天平重复性误差引入的不确定度为：
u(m2)=0.1mg/
=0.0577 mg
4.2.1.3 天平示值误差产生的误差引人的标准不确定度u(m3)
方法中样品称取0.15 g，精确至0.0001 g，根据天平检定证书，当称样量不大于5×104 mg时，天平示值误差为0.6 mg，按均匀分布B类评定，k=
，则天平示值误差引入的不确定度为：
u(m3)=0.6 mg/
=0.3464 mg
样品称量时每次都需要清零，实际上是一次称样，因此，试样称量引入的合成标准不确定度u2.1为：
u2.1=
=0.3916 mg
称取样品12次，其平均质量为0.1542g，则相对标准不确定度urel2.1：
urel2.1=u2.1/m=0.3916 mg/154.2 mg=0.00254
4.2.2 单标线移液管引入的不确定度u2.2。
样品配制过程中用到10 mL和1 mL移液管，室温情况下，样品溶液配制，量取10 mL溶剂，检定证书上给出移液管检定级别为A级，容量允差为±0.030 mL，该分布为均匀分布，k=
，
u2.2.1=0.030 mL/
= 0.0173 mL
单刻度吸量管所引入的相对不确定度：
urel2.2.1= 0.0173 mL/10 mL=0.00173
1 mL移液管所引入的相对不确定度同4.1.3 urel2.2.2= 0.0059 mL /1 mL=0.0059，那么移液管所引入的相对不确定度为urel2.2为0.0061。
样品溶液配制引入的相对不确定度urel2：
urel2=
=0.0066
4.3重复性测量引入的不确定度 u3
检测方法重复性误差的不确定度属于A类不确定度评定，可用多次独立重复测量来进行评定。考虑到人员的操作，安排3个人平均每个人测定4次，按照上述分析过程同时进行处理，制备好待测溶液，在相同的气相色谱仪的条件下，测定已制备好的12份待测溶液中反式茴香脑的浓度，实验数据和分析结果见表1。
表1实验重复性八角茴香样品检测结果
本次共测量 3个样品，样品含量平均值为1.8%，利用预评估的标准偏差，按照下式计算本次测量平均值的标准偏差带来的不确定度：本次重复性实验引入的相对标准不确定度为：
u1 =S/
=0.0646%/
=0.0457%urel1=0.0457%/1.8%=0.0254
5 合成标准不确定度
通过分析血竭中血竭素含量测定结果的相对不确定度分量结果，发现其中标准溶液配制引入的不确定度最大，而影响反式茴香脑含量测定结果的合成相对标准不确定度为：见下图2
合成相对标准不确定度按照下面公式计算：
ure l(w)=
=0.027
当采液相色谱法测定血竭中血竭素含量为1.8%时，合成标准不确定度为：
u(w)= ure l(w) ×0.0550=1.8% ×0.027=0.05%
6 扩展不确定度
当该测量误差的分布类型属于正态分布，置信水平为95%，扩展因子k=2时，则扩展不确定度为：
U=u(w) ×k=0.05%×2=0.1%
7 结论
本文评定了液相色谱测定血竭中血竭素含量的测量不确定度，利用可得到的信息，讨论了测量不确定度的来源，如对样品测量重复性、样品溶液制备及配制标准溶液等产生的不确定度分量进行量化，得到血竭中血竭素1.8%的测量扩展不确定度是0.1%，发现当采用多次重复测量数据平均值作为最后结果时，样品测定重复性引人的不确定度最大。因此，在采用液相色谱法测定血竭中血竭素含量时样品制备重复性应给予足够的重视，且建议报出数据时尽量做3个以上的实验重复，以减小血竭中血竭素测量结果的分散性，使测量结果的表达更加客观和真实。
参考文献
[1] 国家药典委员会, 中华人民共和国药典: 2020年版第一部. 北京: 中国医药科技出版社.
[2] 中国合格评定国家认可委员会. CNAS-CL0I-G003测量不确定度的要求[M]. 北京: 中国计量出版社，2019．
[3] 中国合格评定国家认可委员会. CNAS-GL006化学分析中不确定度的评估指南[M]. 北京: 中国计量出版社, 2018．
[4] GB/T 27418-2017, 测量不确定度评定和表示
[5] GB/T 27025-2008, 检测和校准实验室能力的通用要求
仪器信息网“仪友会”招募令
科学仪器品牌联合“仪器心得”征文活动
【生活中的仪器检测】有奖征文
LC-MS实验瓶颈的突破与优化
