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GST标签蛋白纯化原理、应用及常见问题解析
Ins_bf0c01c3
2023/08/31
私聊
生命科学仪器综合讨论
GST
标签蛋白纯化原理:
谷胱甘肽
-S-
转移酶
(GST)
是一个由
211
个氨基酸组成的大小为
26kDa
序列,它是另一种广泛使用的可提高靶蛋白的溶解度亲和标签。
GST
标签与固定化的谷胱甘肽具有亲和力,常用于原核表达。它可以与一个蛋白的
N
端或
C
端融合。
谷胱甘肽亲和是一种有效的一步纯化
GST(
谷胱甘肽
S-
转移酶
)
标签蛋白的方法。
GST
可作为一种可溶性蛋白在大肠杆菌细胞质中大量表达,并具有完全的酶活性。此外,许多在大肠杆菌中表达时不溶的真核蛋白,在表达为
GST
标签蛋白时被证明至少部分可溶。
谷胱甘肽
S-
转移酶(
GST
)的应用:
谷胱甘肽
S-
转移酶(
GST
)是具有多基因、多功能的
II
相代谢酶家族成员,广泛存在于动物、植物、昆虫、真菌、酵母和各种细菌中。能够催化还原型谷胱甘肽与各种亲电化合物进行亲核加成反应,从而使其极性提高,易于从尿液中排出。因此,
GST
家族蛋白是一类在外源化合物生物转化、保护机体免受过氧化作用损害和药物代谢过程中的一类极为重要的多功能蛋白质。
在生物研究领域,来源于日本血吸虫的谷胱甘肽巯基转移酶(
GST
)标签,是目前应用最为广泛的融合标签之一。融合标签技术是利用
DNA
重组技术将某种标签编码基因融合于目的基因的
3
′端或
5
′端,再通过适宜的宿主来表达融合蛋白。表达的融合蛋白可以通过其融合标签与包被在固相基质上的特异性配基结合,从而纯化出融合蛋白。
1988
年,
Smith
和
Johnson
首次提出
GST
融合蛋白的亲和纯化法,此后广泛使用。目前,国内外纯化
GST
融合蛋白的主要方法是亲和纯化法。
GST
标签蛋白亲和纯化,其配基通常是
GST
的底物谷胱甘肽(
GSH
),通过酶与底物的特异性结合来实现
GST
蛋白的分离纯化。其原理是:在固相基质上通过巯基结合一个谷胱甘肽,然后利用谷胱甘肽与谷胱甘肽巯基转移酶之间的特异性作用力,使得带
GST
标签的融合蛋白与基质上的谷胱甘肽结合,达到分离纯化的目的。
自
GST
融合蛋白亲和纯化法问世以来,
GST-pull down
技术也随即成为一种研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的热门手段。该技术的原理是:利用重组技术将诱饵蛋白与
GST
标签融合表达,融合表达的蛋白经纯化后与待测蛋白共同孵育,并用
GST
琼脂糖凝胶或
GST
琼脂糖磁珠将其分离下来,再通过
SDS-PAGE
鉴定待测蛋白与诱饵蛋白的相互作用。这种方法简单易行,操作简单。此外,
GST
标签还有助于对目标蛋白的检测。
GST
标签蛋白纯化
常见问题解答:
为什么使用
GST
标签来表达和生产蛋白?
在蛋白
N
端添加
GST
标签有利于通过
GSH
亲和树脂对其进行检测、分离和纯化。更重要的是,由于
GST
是具有很好的溶解性的高表达的蛋白,将难以表达的蛋白与
GST
标签相融合,有时可以显著提高重组蛋白的表达量和溶解性。
纯化后如何裂解
GST
标签?
在某些应用(如蛋白的结晶)中需要去除
GST
标签。为了裂解
GST
标签,需要在标签和蛋白之间设计一个蛋白酶裂解位点。在
GST
标签后面的
EK
裂解位点
(GST-EK
位点
-
蛋白结构
)
可以使
GST
标签和裂解位点完全去除,在
GST
标签的特异裂解后不留下任何额外的氨基酸。
GST
标签纯化蛋白的优劣势?
优势:
1.
适用范围广,可在不同宿主中表达;
2.
增强外源蛋白可溶性;
3.
可用不同的蛋白酶进行去除;
4.
有助于保持蛋白的抗原性与生物活性,提高外源蛋白的稳定性;
5.
特异性好,纯化方便且温和。
劣势:
1.
分子量较大,可能会影响蛋白质的功能和下游实验;
2.
仅能纯化可溶性蛋白,若蛋白不可溶,则很难用变性的方法纯化。
更多详情可以关注:义翘神州
GST
标签
https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/gst-tag-protein-expression
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