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单个b细胞抗体制备技术工作流程

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2023/08/31

生命科学仪器综合讨论

目前有多种方法可用于开发单克隆抗体。杂交瘤技术是经典的抗体开发技术，但效率相对较低，而且容易丢失抗体的多样性。噬菌体展示技术广泛用于单抗开发，但容易丢失抗体的天然配对信息。

一般认为，在抗体开发中，保留B细胞的天然VH和VL配对是十分重要的。近年来兴起的单个B细胞技术保留了轻重链可变区的天然配对，具有简单快捷、所需细胞数量较少、效率高等优势。该技术通过直接扩增单B细胞的VH和VL编码基因，是一种从人和免疫动物中制备单克隆抗体的有力技术。

利用单B细胞分选平台，义翘神州可向全球客户提供单B细胞抗体制备服务，整个过程涉及单B细胞分离、测序、克隆和单B细胞抗体筛选等步骤。

单B细胞抗体发现的工作流程

1）单个B细胞的分离

从外周血或淋巴组织中分离单B细胞，有随机分离和抗原特异性分离两种方式。随机B细胞分离，可通过显微操作、激光捕获显微切割和荧光激活细胞分选（FACS）等进行细胞挑选。抗原特异性分离可通过抗原包被磁珠、多参数FACS的荧光素标记抗原、溶血斑块实验和荧光焦点法等方法进行抗原特异性B细胞的筛选。

利用FACS技术，可以根据特定细胞表面标志物的表达模式，明确区分待分选B细胞的发育和分化阶段，几乎任何阶段的B细胞都可以分选。为了有效获得特异性抗体，必须评估供体的免疫应答，例如，在单细胞分离之前，使用酶联免疫斑点技术（ELISPOT）测定外周血中抗体特异性细胞（ASC）的丰度，从而选择含抗原特异性抗体浓度较高的血样进行后续抗体制备。

2）单B细胞抗体的测序和克隆

通常在96孔板上进行单细胞的cDNA合成。全长Ig基因转录产物通过巢式或半巢式RT-PCR进行扩增。通常情况下，对抗体重链轻链可变区不同前导序列设计前向引物的混合物，反向引物特异性互补于抗体恒定区。某些情况下，如果分离和扩增不同同种型的抗体，反向引物则是特异性互补于各种同种型抗体恒定区的混合物。表达载体可直接转染至哺乳动物细胞中，用于单克隆抗体的体外表达。

3）抗体的表达和筛选

鉴定抗体或片段的抗原特异性和生物活性之前，需将携带有抗体基因的表达载体在相应系统中表达。最简单和最常见表达系统是原核系统（例如大肠杆菌），而哺乳动物细胞系统（例如HEK 293、CHO细胞）更有利于抗体的翻译后修饰，主要是瞬时表达或稳定表达。在E. coli中，通常抗体基因表达为抗原结合片段（Fab）的形式，而在哺乳动物细胞中，以完整的IgG形式表达。

义翘神州提供单个B细胞抗体服务，包含：流式单B细胞服务和基于Beacon®平台的单B细胞抗体开发，更多详情可以关注：https://cn.sinobiological.com/services/single-b-cell-antibody-service

文章来源：单B细胞抗体技术：https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/single-b-cell-technology

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