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蛋白纯化常见问题FAQ解析
Ins_bf0c01c3
2023/09/11
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生命科学仪器综合讨论
蛋白纯化是生物研究常用的一种技术,是指从蛋白混合物中得到纯度较高的某种蛋白的过程。根据样本和杂质的特性选择适合的纯化方法,纯化技术的选择要简单化,并且要产生最佳的纯化效果。如果纯度的要求很高,再增加一个离子交换或疏水作用色谱的额外中间步骤。不过尽量尝试使用尽可能少的步骤,因为步骤增多会降低总蛋白产出量。亲和步骤常用重力柱,有时其他色谱步骤中会使用恒压泵,然而蛋白纯化系统将提供更多的控制,可获得更详细的目标蛋白和杂质信息,并为色谱柱提供更好的保护。下面是关于蛋白纯化常见问题
FAQ
解析:
1.
通过
His
标签纯化的蛋白,杂带比较多,如何改进?
(
1
)如果纯化的是上清,蛋白酶会部分降解目的蛋白,可通过加多种蛋白酶抑制剂改进。
(
2
)可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度,以降低杂蛋白与镍柱的亲和力。
(
3
)杂蛋白和目的蛋白结合,可通过超声前加入去垢剂的方式消除
(1%-2%Tritonx-100)
。
2.
镍柱使用中出现棕色是怎么回事
?
出现这样的情况,主要是缓冲液中
DTT
的影响,
DTT
会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响,在碱性的缓冲液条件下镍离子会被
DTT
还原生成
棕色的沉淀,所以所有镍柱的生产商都强调要尽量避免
DTT
的参与(一般的镍柱耐受小于
5mM DTT,
推荐缓冲液中不要超过
2mM DTT
)。
3.
镍柱堵了怎么办?
(
1
)柱子发生堵塞,可能是样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致,所以样品一定要高速离心。
(
2
)上清纯化时,蛋白发生变性,有絮状物产生,赶紧加入
1-2mM DTT (
上清样品处理要在冰浴中进行
)
,还不行加尿素变性,使其在变形环境下。
(
3
)样品处理时的料液比不要太小,否则黏度大,或者导致蛋白析出或变性,料液比要在
1/10-1/15
之间较适宜。
4.
纯化过程中,蛋白出现了浑浊,怎么办?
(
1
)出现浑浊,说明蛋白处在不稳定的环境中或者自身就不稳定,所以要检查缓冲体系是否正确,环境是否低温,或在缓冲液中加入还原剂
DTT
。
(
2
)加入肌氨酸钠,迅速使蛋白变性,消除浑浊现象。
5.
没能纯化到带
His
标签的蛋白,蛋白都流穿了(未挂柱)?
(
1
)超声的功率不对
(
太大,蛋白炭化,太小,蛋白没有释放
)
;
策略:改变超声功率,并在超声前加入溶菌酶。
(
2
)样品或者是结合缓冲液不正确 ;
策略:检测
pH
及样品和结合缓冲液的组成份(
EDTA
)。
(
3
)组氨酸的标签没有完全的暴露 ;
策略:在变性条件下
(
用
8M
脲,
6M
盐酸胍
,1%SDS)
并加入
1-2mMDTT
进行纯化。
(
4
)
His
标签丢失;
策略
1
:
WB
或者
anti-his
的抗体检查
His
是否表达,上游构建,改变
his-tag
的位
(C-terminal or N-terminal)
,必要时增加
his
个数
(
常用
6-10
个
)
;
策略
2
:孵育的时间不够,降低流速和增加孵育的时间;
策略
3
:改变螯合的金属离子,寻找到最佳的结合金属离子。
Ni2+
通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数
(
组氨酸
)6
标记的重组蛋白质的首选金属离子,也是一般最常用的离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响,包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的
pH
,因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用
Ni2+
。可以利用
Hitrap IMACHP
来筛选不同的金属离子。
6.
蛋白挂在柱子上洗脱不下来
,
怎么解决?
(
1
)洗脱条件太温和(组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上,结合力较强) 策略:用增加咪唑的梯度洗脱或降低
pH
来找出最佳的洗脱条件。
(
2
)降低
PH
的方法洗脱的
,
因 为若
PH
低于
3.5,
会导致镍离子脱落 策略:改变洗脱办法
,
咪唑竞争性洗脱
(
3
)蛋白已沉淀在柱上 策略:减少上样量和孵育的时间,试用去污剂
(1%-2%Tritonx-100)
或改变
NaCl
的浓度,或在变性条件下洗脱
(
用
8M
脲,或
6M
盐酸胍
)
,最终也可在洗脱
Buffer
中加入
2mMDTT
或者
0.5%
肌氨酸钠进行洗脱。
(
4
)非特异性疏水或其他相互反应 策略:加非离子去污剂到洗脱缓冲液(如,
2%Triton X-100
)或增加
NaCl
的浓度。
7.
如何处理样品,可使其初步提纯(如何洗去蛋白的自身带)?
(
1
)上清样品处理,要加入去污剂,蛋白酶抑制剂,还原剂,还要注意温度及超声破碎的参数。
(
2
)去大肠杆菌自身带(两条
30KD-40KD
)可用非变性缓冲液超声悬浮(加入去垢剂),离心
6000r/min,30min,10
℃。(若效果不够可继续上述步骤)。
(
3
)大肠杆菌包涵体的洗涤,可用包涵体洗液多洗几遍,也可用
1M/2M/4M/8M
尿素逐步溶解,可选取其中纯度最佳的。
(
4
)可用硫酸铵沉淀法,初步提纯。
更多
重组蛋白纯化
详情可以关注:
https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-protocol
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