qPCR定量分析原理及荧光标记方法有哪些？

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2023/09/14

私聊

生命科学仪器综合讨论

qRT-PCR常常被用来对RNA-seq或芯片测序得到的有意义的基因表达情况进行准确的定量分析，本文主要从qRT-PCR的原理、定量方法等方面进行讲解。

区别	荧光定量PCR	常规PCR
检测时间	实时+终点	终点
检测信号	荧光染料或者探针	核酸染料
准确度	定量	半定量
是否能检测终点产物	能	能
是否能计算起始浓度	能	否
仪器要求	荧光定量PCR仪	常规PCR仪

一、qRT-PCR定量原理

qRT-PCR，即实时荧光定量PCR，就是通过对PCR扩增反应每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板的定量分析。因为在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以可以定量。（Ct 值：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 (cycle)，Ct 值越小，反应扩增到达平台期所需循环数越少，目的基因起始含量越高）。

qPCR的荧光标记方法分为以SYBR Green I染料法为主的荧光染料嵌合法，以Taqman探针法为主的荧光探针法（Cycling Probe，Molecular Bracon等），淬灭染料引物法。

①SYBR Green I染料法

SYBR Green I 是高灵敏度的非特异性双链DNA荧光染料，具有绿色激发波长。它以非特异性方式结合在dsDNA双螺旋小沟区域。游离的SYBR Green I 只发出微弱的荧光信号，PCR过程中，当扩增生成dsDNA时，SYBR Green I 逐渐与dsDNA结合，荧光信号被千倍放大，荧光信号的强度与扩增得到的dsDNA的浓度成正比。荧光信号被仪器检测并采集得到“扩增曲线”，通过荧光信号的强度反映出体系中dsDNA的浓度。

但SYBR Green I 与特异性扩增产物结合时还可以同引物二聚体、非特异性扩增的dsDNA结合，影响结果判断。所以扩增反应结束后，还必须对生成的dsDNA进行分析：即通过升温，dsDNA双链解开，SYBR Green I 染料脱落，荧光值逐渐下降，形成温度和荧光强度的曲线即“熔解曲线（Melting curve）”，由此判断体系中是否存在引物二聚体、非特异性扩增。

SYBR Green I 染料法操作简单、灵敏度高、成本较低，被广泛地应用于DNA及RNA定量、基因表达量的研究、转基因重组动植物的研究等。

②Taqman探针法

Taqman探针是由5’端标记有荧光报告基团和3’端标记有淬灭基团以及与目标基因特异性结合的寡核苷酸序列组成。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，此时仪器不会检测到荧光信号。在PCR扩增时，模板DNA变性解链，Taqman探针特异性结合到目标基因处，而Taq酶具有5’-3’核酸外切酶活性，延伸至探针结合处，可将探针水解，使荧光报告基团和淬灭基团分离，从而检测到荧光信号，荧光信号的强度与扩增得到的dsDNA的浓度成正比。荧光信号被仪器检测并采集得到“扩增曲线”，通过荧光信号的强度反映出体系中dsDNA的浓度。

Taqman探针法因其特异性高，被广泛地应用于等位基因鉴别、SNP分型、病原体和病毒检测、疾病耐药基因研究、多重定量等。

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