超高效液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿配方奶粉中叶酸的含量
户江涛
（黑龙江省农垦科学院测试化验中心，黑龙江 佳木斯 154007 ）
摘要：本实验建立了超高效液相色谱-串联质谱法建立了检测婴幼儿配方奶粉中叶酸含量的分析方法。试样经50℃热水溶解，超声提取，等电法去除蛋白后，在T3色谱柱上以0.1%甲酸水和乙腈为流动相进行液相色谱分离，质谱检测采用电喷雾正离子化模式和多反应监测模式（MRM）。结果表明该方法在浓度范围内线性关系良好，相关系数（r）为0.9998，定量下限（LOQ）为10 ug/100 g，加标回收率为83.7%~101%，相对标准偏差（RSD）为2.5%~5.1%（n=6）。本方法快速、灵敏、准确，特别适和大批量婴幼儿配方奶粉中叶酸含量检测。
关键词：超高效液相色谱-串联质谱；婴幼儿配方奶粉；叶酸
Determination of Folic acid in infant formula by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
HU Jiangtao
(Testing and Analysis Center of Heilongjiang Academy of Land Reclamation Sciences, Jiamusi 154007,China)
Abstract：A method was developed for the determination of Folic acid in infant formula by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS). The samples were disolved by 50℃ water，extracted by ultrasound，after protein was removed by Isoelectric method, Folic acid was separated on a Waters HSS T3 column with gradient elution with the mobile phase of 0.1% formic acid and acetonitrile, and finally detected by positive eletrospray ionization-mass spectrometry(ESI+-MS/MS) in multiple reaction monitoring(MRM) mode. The results showed the linearity of Folic acid was good in the concentration range of 0.02~1 mg/L, and the correlation coefficient was 0.9998. The limit of quantification(LOQ) was 10 ug/100 g，the mean recovery was 83.7%~101%, and the relative standard deviation(RSD) was 2.5%~5.1%（n=6）.This method is rapid, sensitive, accurate and suitable for simultaneous determination of Folic acid in infant formula.
Key words: UPLC-MS/MS; infant formula; Folic acid
叶酸（C19H19N7O6 ），又名维生素B9，是一种水溶性维生素，在人类蛋白质合成、细胞分裂与生长过程中具有重要作用。叶酸缺乏可能会引起婴幼儿发生神经闭合不完全，从而导致神经性厌食症，叶酸虽然广泛存在于如菠菜等绿叶蔬菜及肝脏等动物源食品中，但在婴幼儿阶段（特别小于6个月婴儿）很长一段时间不能直接食用这些辅食，这时婴幼儿配方奶粉便成为婴幼儿获取叶酸的重要途径，因此准确测定婴幼儿配方奶粉中叶酸含量有重要意义。
目前食品中叶酸测定的国标方法《GB 5009.211-2022 食品安全国家标准 食品中叶酸的测定》为微生物法，该方法是将鼠李糖乳杆菌接种至含有叶酸的培养基中，培养一段时间后测定吸光度，利用在一定范围内叶酸含量与吸光度值符合某种规律而得到叶酸含量数值。该方法对菌种活力、培养条件、检验人员操作水平要求较高，检测周期较长，且容易受到基质干扰、检测结果重复性往往较差。因此，制定一种准确、高效、快速测定婴幼儿配方奶粉中叶酸的检测方法十分必要。
液相色谱-串联质谱测定法具有前处理简单、分析速度快、抗基质干扰能力强等优点，能有效避免叶酸在长时间、繁琐的前处理及检测过程中损失，可以为奶粉中叶酸含量的测定提供一种有效的检测手段。本文建立的超高效液相色谱-串联质谱法测定奶粉中叶酸含量的方法前处理过程简便、分析时间短、灵敏度高、抗干扰能力强，且用到的都是实验室常用试剂，实验成本较低，特别适用于大批量婴幼儿配方奶粉中叶酸含量的检测。
1 实验部分
1.1 材料与试剂
叶酸（纯度≥99%，Dr公司）；乙腈、甲酸（色谱纯，Fisher公司）；盐酸、氢氧化钠（优级纯，科密欧公司）；0.2 um水系滤膜；实验用水为Millipore纯水仪制备。
1.2 仪器与设备
UPLC XEVO TQ-MS超高效液相色谱串联质谱仪（Waters公司）；涡旋振荡器。
1.3 叶酸标准储备液的配置
称取一定量叶酸标准品，用甲醇配置成质量浓度为100 ug/mL标准储备液，于-18℃冰箱保存，待用；临用前将溶液回温至室温，并吸取一定体积储备液用水逐级稀释成所需浓度的标准工作液。
1.4 样品前处理
准确称取2.00 g(精确到0.01 g) 婴幼儿配方奶粉试样于50 mL刻度离心管中，加入10 mL 50℃纯水使奶粉充分溶解，超声提取10 min，然后用2 mol/L盐酸调节试样pH值至1.7，静置5 min后用2 mol/L氢氧化钠调节试样溶液pH至4.5，用纯水定容至25 mL，在离心机中以10000 r/min离心10 min，取上清液过0.2 um水系微孔滤膜后供UPLC-MS/MS分析测定。
1.5 液相色谱及质谱条件
液相色谱：色谱柱:Waters HSS T3（1.8 μm，50mm×2.1mm）；柱温：35℃；流速：0.3 mL/min；进样量：2 μL；流动相A：乙腈；流动相B：0.1%的甲酸水溶液。梯度洗脱程序：0~0.5min，5% A；0.5~3. 0 min，5%~100% A；3. 0 ~4. 0 min，100%A，4 ~4.1min，100% A~5% A，4.1 ~5.0min 5% A。
质谱：离子源：电喷雾离子源( ESI + ) ；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测( MRM)；毛细管电压：3.0 kv；离子源温度：150℃；去溶剂气温度：500℃；去溶剂气流量：1000 L /h；定性、定量离子对及碰撞能量见表1。
表1叶酸的质谱参数
分析物 | 锥孔电压/V | 母离子/(m/z) | 子离子/(m/z) | 碰撞能量/V |
叶酸
| 18
| 442.3
| 295﹡
176
| 18 30
|
﹡为定量离子
2 结果与讨论
2.1 色谱质谱条件及前处理过程的优化
流动相的选择：B族维生素在酸性条件下比较稳定，对比了酸性体系（0.1%甲酸水溶液）与甲醇、乙腈的流动相体系组合，发现叶酸在乙腈体系中响应值更高，故本研究采用0.1%甲酸水溶液+乙腈流动相体系。
色谱柱的选择：比较了Waters BEH C18（1.7 μm，50mm×2.1mm）和Waters HSS T3（1.8 μm，50mm×2.1mm）两种不同填料的分析柱，实验时发现目标物在C18上保留比T3弱，考虑到若出峰太早可能造成奶粉中一些极性强的基质随目标物共流出，可能会干扰目标物测定，因此本方法采用了HSS T3色谱柱。
质谱参数优化：将1.0 mg/L 叶酸标准溶液直接注射到质谱中，在正离子模式下分别进行母离子和子离子全扫描，同时优化质谱条件，找到两对响应好高、干扰小的子离子对，最终确定的质谱条件见表1，相应的色谱质谱图见图1、图2。
前处理过程优化：叶酸属于水溶性维生素，易于氧化，这个实验过程需在避光条件下进行。通过查阅相关文献的前处理方法，发现通过先酸化样品再用NaOH调节pH的等电法去除蛋白方式，可以得到很好的提取和净化效果，能大大减少奶粉中蛋白等大分子基质对目标物干扰；调节pH后的溶液产生了蛋白沉淀，需要用过滤或离心方式予以去除，通过实验比较了过滤和离心去除蛋白沉淀的效果，发现高速离心后得到的上清液明显更容易通过0.2 um水系滤膜，综合以上因素本实验最终采用了1.4的前处理方法。
图1 叶酸标准溶液（1 ug/mL）MRM色谱图
图2 奶粉样品中叶酸MRM色谱图
2.2 线性范围和定量限
吸取不同体积的叶酸标准储备液（1.3），用纯水分别配置不同浓度的上机标准溶液，以各自定量离子的峰面积为Y对应质量浓度X（mg/L）做标准曲线，得到的线性方程和相关系数见表2；以10倍信噪比（S/N）计算得到叶酸的定量下限，结果见表2。
表2 叶酸标准溶液的线性方程、相关系数和定量下限（LOQ）
分析物 | 线性范围/(mg/L) | 线性方程 | R | LOQ/(ug/100 g) |
叶酸 | 0.02~1
| Y=12793X-56.759
| 0.9998
| 10 |
2.3回收率和精密度
选用不添加叶酸的奶粉样品作为基质进行加标。添加水平为：20，100，200 ug/100g。每个水平重复6次，同时做该奶粉的本底实验。按照1.4前处理方法处理后上机检测，回收率计算结果见表3。结果表明，该方法叶酸的平均回收率为83.7%~101%，相对标准偏差（RSD，n=6）为2.5%~5.1%，均满足实验要求。
表3 奶粉叶酸的加标回收率和相对标准偏差（n=6）
分析物 | 添加水平(ug/100g) | 回收率/% | 相对标准偏差/% |
叶酸
| 20 100 200 | 89.0±5.3 95.3±2.7 98.5±2.5
| 5.1 3.2 2.5
|
2.4实际样品分析
采用本方法随机抽取市售8批次婴幼儿配方奶粉，对其叶酸含量进行测定，实测值、标示值及实测值与标示值比值见表4。结果表明，这些样品中叶酸实测含量均符合《GB 28050-2011 食品安全国家标准 预包装食品营养标签通则》中对维生素等营养成分的规定——婴幼儿配方奶粉中叶酸实际含量不应低于标示值的80%。
表4 实际样品中叶酸实测值与标示值比对结果
样品编号 | 实测值(ug/100g) | 标示值(ug/100g) | 比值 |
1
2
3
4
5
6
7
8
| 65 156 103.2 57 117 86.5 79 101 |
81.3
203
230
134
106
146
198
185
| 1.25
1.30
2.23
2.35
0.91
1.69
2.51
1.83
|
3 结语
本文建立了超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定婴幼儿配方奶粉中叶酸含量的分析方法。该方法具有较高的灵敏度、准确度和精密度，前处理快速、简单，特别适合大批量样品的检测。
参考文献：
[1] GB 5009.211-2016 食品安全国家标准 食品中叶酸的测定.
[2] GB 28050-2011 食品安全国家标准 预包装食品营养标签通则.
[3]张丽芳,张鑫,周鑫，等. 高效液相色谱法同时测定婴幼儿奶粉中7种水溶性维生素[J]. 食品工业，2022,43(01): 277-280.
[4]刘娜,陈大舟,汤桦，等. 婴幼儿奶粉中8种水溶性维生素的高效液相色谱同时测定[J]. 分析测试学报，2008,27(4): 408-411.
[5]严华,崔凤云,别玮，等. 超高效液相色谱-同位素稀释质谱法同时测定婴幼儿奶粉中10种水溶性维生素 [J]. 食品安全质量检测学报，2020,17(11): 5871-5878.
[6]郭建博,宋莉,牟霄，等.超高效液相色谱法快速测定复合维生素产品中的10种水溶性维生素 [J]. 食品安全质量检测学报，2017,8(5): 1794-1799.
[7]夏静,俞婧,孙磊，等.功能性饮料中9种水溶性维生素的HPLC-MS-MS同步检测技术 [J]. 食品科学，2014,35(12): 196-199.
应助达人
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