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质粒DNA制备基本原理及方法
Ins_bf0c01c3
2023/10/09
私聊
生命科学仪器综合讨论
质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位,当前通常用其来特指细菌、真菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的
DNA
分子。
在基因工程领域,质粒常常被当做基因的载体使用。在分子生物学中,质粒
DNA
被当做基因运载工具具有非常广泛的应用。
在质粒
DNA
的应用过程中,其纯度对于酶切、
PCR
扩增等实验结果有着比较大的影响,因此需要保证质粒
DNA
提取的纯度和效率。
在细菌中提取质粒
DNA
通常按照以下步骤进行
:
第一步,培养细菌,使质粒扩增
;
第二步,进行细菌的收集和裂解
;
第三步,质粒
DNA
的分离和纯化。
在质粒
DNA
的提取过程中,其提取效果和其大小呈现出正比例关系,越小越容易进行提取,这主要是由于,如果质粒
DNA
比较大的话,其特性机会和染色体
DNA
比较接近,这样想要将二者分离开来难度就会变大。
在进行质粒
DNA
的分离时,适宜的条件是非常重要的,主要包括
pH
值、
SDS
浓度、时间和溶菌温度等,在适宜的条件下质粒
DNA
和染色体
DNA
才能够更好的分离开来。
细菌浓度对于质粒
DNA
的提取也是非常重要的,如果细菌的浓度比较高,那么在溶菌时,溶菌液很难和细菌液充分混合,导致溶菌不彻底的问题,这样会造成质粒的回收率比较低;
而如果细菌溶度比较低,溶菌液和菌液均分混合,会造成溶液中含有较多的蛋白质、染色体以及菌体碎片,在这样的情况下,沉淀时质粒回合这些物质共沉,进而导致质粒的回收率也会比较低。
在生物学的相关研究之中,细菌质粒
DNA
的提取是比较常规的技术和操作,主要的方法有碱裂解法、煮沸法以及
SDS
裂解法等,下面对碱裂解法进行介绍。
碱裂解法
碱裂解法是当前应用比较广泛的质粒
DNA
提取方法,这种方法的优点在于提取的质粒
DNA
纯度高,操作便捷,缺点是需要较长的提纯时间。研究人员在缩短这一方法的提纯时间方面做了大量的研究,但是没有得到理想的效果,当前这一方法提取
DNA
的时间都在
1.5h
以上。
碱裂解法提取质粒
DNA
的基本原理
:
首选,在菌液中加入溶液Ⅰ,细菌细胞悬浮,同时其中的
EDTA
会和
Ca2+
以及
Mg2+
鳌合,起到抑制
DNase
活性的作用;然后,加入溶液Ⅱ,将细胞裂解,在这个过程中蛋白质和少量质粒将会变质;
再次,加入溶液
Ⅲ,使多数蛋白质以及染色体
DNA
被沉淀,并使得质粒
DNA
复性。其中,该方法中起到裂解细菌作用的主要是溶液Ⅱ中的
NaOH
,正因如此该方法被称为碱裂解法,如果将其换为
SDS
,也能够提取出少量的质粒
DNA
,这是由于
SDS
也是碱性的,可以一定程度上破坏细菌的细胞膜。
在这一方法中需要注意,
NaOH
溶液要现用现配,这个主要是由于其能够和空气中的
CO2
反应,从而使溶液的碱性降低,这样会影响提纯的效率。
另外在加入溶液
Ⅱ之后,操作时间不能够过长,这是因为染色体
DNA
在碱性条件下片段会慢慢断裂。另外需要注意的是,在操作过程中,混匀是一定要轻柔,从而在保证细菌沉淀可以充分的扩散在试剂中的前提下,避免已变性质粒
DNA
和染色体基因组
DNA
被机械剪切。
此外,在溶液
Ⅲ加入之后,其中的
SDS
会和蛋白质结合,会产生大量的沉淀,
SDS
还会和醋酸钾结合,生成
PDS
,这一物质的溶解度远低于
SDS
,从而可以将大部分蛋白质和染色体
DNA
共沉淀,进而获得质粒。
义翘神州能够提供快速、高通量、高品质以及个性化的
质粒
DNA
制备服务
。不仅满足实验室研究人员的小量质粒
DNA
制备需求,也可为生物工业用户和医药公司等提供大规模的质粒
DNA
制备服务。义翘神州升级改造后的质粒
DNA
制备平台,采用
GMP
级别的生产线,对过程和最终产品的严格管控,确保了最终产品质量符合客户需求。义翘神州可以提供从μ
g
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级别不同规模的科研级和工业级别的质粒生产服务,满足不同的需求。更多详情可以参看:
http://cn.sinobiological.com/services/plasmid-dna-preparation-service
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