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蛋白纯化过程中的七大常见问题详解
Ins_bf0c01c3
2023/10/24
私聊
生命科学仪器综合讨论
重组蛋白的纯化是生物学研究中的重要技术。为了研究蛋白的特定功能和结构,研究人员必须将重组蛋白从生物体中分离并纯化。蛋白纯化方法主要利用不同重组蛋白之间的相似性和差异性。可以根据蛋白之间的相似性去除非蛋白物质,然后根据蛋白之间的差异分离纯化目标重组蛋白。在蛋白纯化的过程中,我们可能会遇到一些问题。让我们一起来看看这些问题,并探讨相应的解决方案吧!
蛋白纯化过程中的七大常见问题详解:
1.
通过
His
标签纯化的蛋白,杂带比较多,如何改进?
①若纯化的是上清液,蛋白酶可能会对目的蛋白产生部分降解作用。为改善此情况,可尝试加入多种蛋白酶抑制剂。
②为降低杂蛋白与镍柱的亲和力,可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度。
③若杂蛋白与目的蛋白结合,可在超声处理前加入适量的去垢剂(如
1%-2% Tritonx-100
),以消除此现象。
2.
镍柱使用中出现棕色是怎么回事
?
当使用镍柱时出现棕色,这主要是由于缓冲液中的
DTT
引起的。
DTT
对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响。在碱性缓冲液条件下,镍离子会被
DTT
还原生成棕色的沉淀。因此,所有的镍柱生产商都强调要尽量避免
DTT
的参与。一般来说,镍柱的耐受性小于
5mM DTT
,推荐缓冲液中不要超过
2mM DTT
。
3.
镍柱堵了怎么办?
①样品处理:在样品中可能存在细胞碎片或其他杂颗粒,这些杂质可能会导致柱子堵塞。因此,在将样品加载到柱子上之前,必须对样品进行高速离心处理,以确保只加载纯净的样品。
②加入蛋白酶抑制剂:如果在纯化上清液时发现蛋白变性,产生了絮状物,应立即加入
1-2mM DTT
,以避免变性导致的蛋白质聚集。加入
DTT
的操作应在冰浴中进行。如果加入
DTT
后问题仍未解决,可以进一步加入尿素以变性蛋白质,使其在变性环境下稳定。
③调整料液比:样品处理时的料液比不要太小,否则黏度大或导致蛋白析出或变性。料液比在
1/10-1/15
之间较为适宜。
4.
纯化过程中,蛋白出现了浑浊,怎么办?
在纯化过程中,如果蛋白出现浑浊,可能是由于蛋白处于不稳定的环境中或其本身不稳定所导致的。因此,需要检查缓冲体系是否正确以及环境是否低温。此外,为了提高蛋白的稳定性,可以在缓冲液中加入还原剂
DTT
。另一种解决方案是加入肌氨酸钠,这可以迅速使蛋白变性并消除浑浊现象。
5.
没能纯化到带
His
标签的蛋白,蛋白都流穿了(未挂柱)?
①超声功率问题:
超声功率过大可能导致蛋白炭化,而过小则可能使蛋白没有充分释放。
策略:尝试调整超声功率,并在超声处理前加入适量的溶菌酶。
②样品及结合缓冲液问题:
样品或结合缓冲液的
pH
值不正确,或缓冲液中的成分(如
EDTA
)可能影响蛋白的结合。
策略:检测样品和结合缓冲液的
pH
值以及成分,确保它们是正确的和适合的。
③组氨酸标签暴露问题:
如果组氨酸标签没有完全暴露,将影响蛋白与镍柱的结合。
策略:在变性条件下(如使用
8M
脲,
6M
盐酸胍,
1%SDS
),并加入
1-2mMDTT
进行纯化。
④
His
标签丢失问题:
His
标签丢失可能是由于蛋白在纯化过程中发生了降解或脱落。
策略
1
:通过
WB
或
anti-his
抗体检查
His
标签是否存在,检查上游构建是否正确,并尝试改变
His-tag
的位置(
C-terminal
或
N-terminal
),必要时增加
His
标签的数量。
策略
2
:孵育时间不足可能导致蛋白未能充分结合。降低流速并增加孵育时间可能有助于提高蛋白的结合效率。
策略
3
:不同的金属离子可能对蛋白与镍柱的结合产生影响。尝试改变螯合的金属离子,寻找到最佳的结合金属离子。例如,
Ni2+
通常是首选的金属离子用于从宿主细胞蛋白中纯化大多数组氨酸
6
标记的重组蛋白质。但是,有些蛋白可能更适合使用其他金属离子进行纯化而非
Ni2+
。可以通过
Hitrap IMACHP
来筛选不同的金属离子。
6.
蛋白挂在柱子上洗脱不下来
,
怎么解决?
①洗脱条件太温和:
如果洗脱条件过于温和,可能导致组氨酸标记的蛋白质仍然与柱子结合,因为结合力较强。
策略:尝试增加咪唑的梯度洗脱,或者降低
pH
来找出最佳的洗脱条件。
②降低
pH
方法洗脱的问题:
如果使用降低
pH
的方法进行洗脱,但
pH
值过低可能会导致镍离子脱落。
策略:改变洗脱方法,使用咪唑竞争性洗脱。
③蛋白已沉淀在柱上的问题:
有时蛋白可能已经沉淀在柱上。
策略:减少上样量和孵育的时间,尝试使用去污剂(如
1%-2% Tritonx-100
)或改变
NaCl
的浓度。还可以在变性条件下进行洗脱(如使用
8M
脲或
6M
盐酸胍),最终也可以在洗脱
Buffer
中加入
2mMDTT
或者
0.5%
肌氨酸钠进行洗脱。
④非特异性疏水或其他相互反应的问题:
可能是由于非特异性疏水或其他相互反应导致蛋白挂在柱子上。
策略:在洗脱缓冲液中加入非离子去污剂(如
2% Triton X-100
)或者增加
NaCl
的浓度。
7.
如何处理样品,可使其初步提纯(如何洗去蛋白的自身带)?
(
1
)上清样品处理,要加入去污剂,蛋白酶抑制剂,还原剂,还要注意温度及超声破碎的参数。
(
2
)去大肠杆菌自身带(两条
30KD-40KD
)可用非变性缓冲液超声悬浮(加入去垢剂),离心
6000r/min,30min,10
℃。(若效果不够可继续上述步骤)。
(
3
)大肠杆菌包涵体的洗涤,可用包涵体洗液多洗几遍,也可用
1M/2M/4M/8M
尿素逐步溶解,可选取其中纯度最佳的。
(
4
)可用硫酸铵沉淀法,初步提纯。
更多关于
蛋白
纯化
相关问题的可以查看
https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification
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