摘要：建立了猪肉、猪肝等动物源性食品中18种β-受体激动剂残留的QuEChERS-UPLC-MS/MS检测方法。样品中的β-受体激动剂用β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶酶解、高氯酸沉淀蛋白、离心后上清液经过乙酸乙酯、叔丁基甲醚萃取，采用QuEChERS法净化，Inspire PFP色谱柱分离，正离子多反应监测模式检测(MRM),内标法定量。该方法18种受体激动剂在1 ng/mL～50 ng/ml范围内线性关系良好(R2>0.99)。方法检出限和定量限分别为 0.2 μg/kg、0.5 μg/kg，加标回收率在72%～118%之间，相对标准偏差为4.28%～10.38%。该方法前处理简单、净化效果好、灵敏度高。可用于动物源性食品中β-受体激动剂残留检测。
关键词：β-受体激动剂；QuEChERS；超高效液相色谱-串联质谱法；猪肉；猪肝
目前β-受体激动剂的检测方法主要有LC-MS 1,2、GC-MS3,4和ELISA5,6。ELISA法操作简单、特异性强适合高通量快速分析，但通常检测种类有限，可能存在假阳性。GC-MS法可以用于多残留检测但是前处理过程需要衍生化，步骤相对复杂。LC-MS是目前检测 β-受体激动剂最常用的方法。样品前处理通常采用固相萃取（SPE）方法，需淋洗、洗脱等过程，本研究采用新型除脂聚合物材料，结合QuEChERS净化原理，建立了一种简单、快速、准确测定动物源性食品中β-受体激动剂残留的方法。
1.仪器设备及试剂耗材
1.1 仪器设备
1.1.1 AB SCIEX 4000+型超高效液相色谱-质谱联用仪(AB公司)
1.1.2 HSC-24B氮吹仪（天津恒奥科技发展有限公司）；
1.1.3 GT10-1型高速离心机（北京时代北利）；
1.1.4 Vortex-5型旋涡混合器（其林贝尔仪器）
1.2试剂耗材
1.2.1甲醇（色谱纯，迪马科技）；
1.2.2乙腈（色谱纯， 迪马科技）；
1.2.3叔丁基甲醚（色谱纯， 迪马科技）；
1.2.4甲酸（色谱纯，迪马科技）；
1.2.5乙酸铵（色谱纯，迪马科技）；
1.2.6葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶（Merck公司）
1.2.7 Inspire PFP液相色谱柱（100×2.1 mm，3 μm，迪马科技）；
1.2.8 ProElut QUE净化管（2 mL，迪马科技）。
1.3标准溶液
1.3.1标准储备液：18种β-受体激动剂混合标准溶液（100 μg/mL，溶剂甲醇，迪马科技）
1.3.2内标储备液：精密称取适量克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D3、西马特罗-D7、齐帕特罗-D7、氯丙那林-D7、特布他林-D9、西布特罗-D9、盐酸马布特罗-D9、盐酸班布特罗-D9、克仑丙罗-D7、盐酸妥布特罗-D9、羟甲基克仑特罗-D6，用甲醇溶解并定容，配制成浓度为10 μg/mL内标储备液。4℃保存，有效期6个月。
1.3.3 标准工作液：准确吸取适量混标储备液，用甲醇稀释并定容，配制成浓度为0.1 μg/mL标准工作液。
1.3.4 内标工作液：准确吸取适量内标储备液，用甲醇稀释并定容，配制成浓度为0.1 μg/mL内标工作液。4℃保存，有效期6个月。
2、样品提取
准确称取样品2.0 g于离心管中，加6 mL 0.2 mol/L乙酸铵缓冲液、40 μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，涡旋混匀，37℃避光水浴16 h，加100 μL 0.1 μg/mL内标工作液，涡旋混匀，8000 rmp离心8 min，取出上清。向下层残渣加5 mL 0.1 mol/L高氯酸溶液，涡旋5 min, 8000 rmp离心8 min，取上清与前一步上清混匀，高氯酸调pH值至1.0±0.2，8000 rmp离心8 min，取出上清，将上清液用10 mol/L NaOH溶液调pH至10.0±0.5。加乙酸乙酯15 mL，涡旋5 min, 5000 rmp离心5 min，取上层有机相。下层水相中再加入10 mL叔丁基甲醚，涡旋5 min, 5000 rmp离心5 min，取上层有机相。合并两次有机相，混匀，50℃水浴氮吹至干，用0.5 mL甲醇溶解残渣,再加入0.5 mL0.1%甲酸水定容到1 mL，混匀，待净化。
3、样品净化
将待净化液全部转移到ProElut QUE净化管中（内含PLS-A净化材料），涡旋2 min, 8000 rmp离心2 min，上清液过尼龙膜，待分析。
4、仪器条件
色谱条件 色谱柱：Inspire PFP，100×2.1 mm，3 μm；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μ L；柱温：35 ℃； 流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸乙腈，梯度洗脱程序：0～2 min，95% A；2～12 min，95% A～40% A;12~15 min,10% A;15~20 min,95% A。质谱条件 离子源：ESI(+)；扫描方式：正离子扫描；检测模式：多反应监测；电喷雾电压：5500 V；雾化气压力：50 psi；辅助气压力：50 psi；气帘气压力：20 psi；离子源温度：500 ℃。定性离子 、定量离子对、碰撞气能量及去簇电压见表1。18种β-受体激动剂和13种内标典型色谱图见图1。
5、结果
猪肉和猪肝中18β-受体激动剂在1 ng/mL～50 ng/ml范围内线性关系良好(R2>0.99)。方法检出限和定量限分别为 0.2 μg/kg、0.5 μg/kg，加标回收率在72%～118%之间，相对标准偏差为4.28%～10.38%。
6. 结论
本文基于超高效液相色谱-串联质谱技术建立了一种快速有效的猪肉、猪肝中18种β-受体激动剂残留检测方法，获得了满意的净化效果和检测灵敏度，回收率和定量限均满足残留分析的要求。
表1 1种β-受体激动剂和13种内标的质谱条件信息表
Tab. 1 MS parameters of 18 β-receptor blockers and 13 internal standard
目标物名称 | 定性离子对 | 定量离子对 | DP | CE |
(m/z) | (m/z) | (V) | (V) |
(母离子/子离子) | (母离子/子离子) |
|
|
克伦特罗 | 277.0/203.0 | 277.0/203.0 | 40 | 21 |
277.0/168.1 | 40 | 38 |
克伦特罗-D9 | 286.0/204.0 | 286.0/204.0 | 50 | 23 |
莱克多巴胺 | 302.2/164.1 | 302.2/164.1 | 40 | 23 |
302.2/107.1 | 40 | 51 |
莱克多巴胺-D6 | 308.1/168.1 | 308.1/168.1 | 40 | 23 |
沙丁胺醇 | 240.2/148.1 | 240.2/148.1 | 40 | 24 |
240.2/222.1 | 40 | 15 |
沙丁胺醇-D3 | 243.1/151.0 | 243.1/151.0 | 30 | 25 |
西马特罗 | 220.0/202.0 | 220.0/202.0 | 40 | 13 |
220.0/160.0 | 40 | 22 |
西马特罗-D7 | 227.2/161.1 | 227.2/161.1 | 40 | 23 |
齐帕特罗 | 262.1/185.0 | 262.1/185.0 | 40 | 32 |
262.1/202.1 | 40 | 25 |
齐帕特罗-D7 | 269.1/185.0 | 269.1/185.0 | 40 | 32 |
氯丙那林 | 214.0/154.1 | 214.0/154.1 | 40 | 23 |
214.0/118.0 | 40 | 34 |
氯丙那林-D7 | 221.0/155.0 | 221.0/155.0 | 40 | 23 |
特布他林 | 226.2/152.0 | 226.2/152.0 | 40 | 21 |
226.2/107.1 | 40 | 36 |
特布他林-D9 | 235.2/153.1 | 235.2/153.1 | 40 | 20 |
西布特罗 | 234.0/160.1 | 234.0/160.1 | 40 | 21 |
234.0/143.0 | 40 | 34 |
西布特罗-D9 | 243.2/161.1 | 243.2/161.1 | 40 | 21 |
马布特罗 | 311.1/237.2 | 311.1/237.2 | 40 | 24 |
311.1/202.1 | 40 | 40 |
马布特罗-D9 | 320.1/238.0 | 320.1/238.0 | 40 | 24 |
溴布特罗 | 367.0/293.0 | 367.0/293.0 | 40 | 24 |
367.0/349.2 | 40 | 17 |
班布特罗 | 368.2/294.1 | 368.2/294.1 | 40 | 26 |
368.2/72.2 | 40 | 37 |
班布特罗-D9 | 377.2/295.1 | 377.2/295.1 | 40 | 26 |
克仑丙罗 | 263.1/245.1 | 263.1/245.1 | 40 | 15 |
263.1/203.0 | 40 | 24 |
克仑丙罗-D7 | 270.0/204.0 | 270.0/204.0 | 40 | 25 |
妥布特罗 | 228.0/154.0 | 228.0/154.0 | 40 | 21 |
228.0/118.0 | 40 | 35 |
妥布特罗-D9 | 237.0/155.0 | 237.0/155.0 | 40 | 21 |
利托君 | 288.1/121.1 | 288.1/121.1 | 45 | 29 |
288.1/150.1 | 45 | 25 |
克仑赛罗 | 319.1/203.0 | 319.1/203.0 | 50 | 26 |
319.1/132.0 | 50 | 39 |
马喷特罗 | 324.9/237.9 | 324.9/237.9 | 50 | 20 |
324.9/217.9 | 50 | 29 |
克仑潘特 | 291.0/203.0 | 291.0/203.0 | 30 | 21 |
291.0/132.1 | 30 | 38 |
羟甲基克仑特罗 | 293.0/203.0 | 293.0/203.0 | 30 | 23 |
293.0/132.1 | 30 | 28 |
羟甲基克仑特罗-D6 | 299.0/203.0 | 299.0/203.0 | 40 | 25 |
注：溴布特罗、马喷特罗采用克伦特罗同位素内标定量，利托君、克仑赛罗、克仑潘特采用莱克多巴胺同位素内标定量。
图1. （10 ng/mL）检测的总离子流图
Fig. 1 Total ion chromatogram of 18 β-receptor blockers (1 ng/mL) and 13 internal standard (10 ng/mL) mixed standard solution
参考文献
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