串联质谱法测定茶叶中16种真菌毒素前处理方法的选择及优化

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2023/10/31
安阳疾控理检队

私聊

液质联用（LCMS）

串联质谱法测定茶叶中16种真菌毒素

前处理方法的选择及优化

采用合适的提取溶剂、利用有效的提取方式和最佳的净化方法是超高效液相色谱串联质谱测定茶叶中16种真菌毒素前极为重要的一步。

提取：由于16种真菌毒素的物理化学性质差异大以及茶叶不同类别基质不同，对常见的提取剂乙腈、甲醇进行试验，用加标回收的方式考察提取效果，综合考虑，选用乙腈作为提取液，选择性和渗透性都好，而且容易进入茶叶组织内，不容易萃取出蜡类、脂肪酸等杂质，有效减少干扰成分，提取回收率高。在提取过程中加NaCl 有利于真菌毒素向乙腈相中转移。常见提取方式有涡旋震荡提取、超声提取、索式提取、加速溶剂萃取、基质分散提取，经比较对比：索式提取回流时间在8-16h，有机溶剂消耗量，人力和经济成本较高。加速溶剂萃取要有专门提取仪器，采用涡旋震荡提取和超声提取效果最好，如两者结合用提取效率没有明显差异，为节约时间、简化操作选涡旋震荡提取。

净化：常用的过柱净化如免疫亲和层析柱、多功能净化柱和固相萃取柱。前者大多只能用于特定真菌毒素的测定。后2种也很难满足茶叶中16种毒素的同时净化。针对茶叶基质样品中所含的大量脂类、蛋白类、糖类、色素等干扰杂质，本试验选用分散固相萃取，对常用的净化剂 C18、GCB、PSA 等试验净化效果，GCB吸附谱较广，去除色素效果明显，PSA去除极性基质，C18吸附非极性到中等极性化合物，除脂效果较好，采用加入C18 粉末、PSA 粉末、GCB、无水硫酸镁进行净化，经比较其用量，增加净化剂用量会导致目标物被吸附，回收率低，量少则导致净化效果降低，综合考虑，选用加入C18 粉末50 mg 、PSA 粉末100mg 、GCB100mg 、无水硫酸镁50 mg，优化后提取回收率改善，提取回收率在70.1%～105.6%之间，净化效果最好。由于茶叶色素很重，除色素很关键，加入甲苯1mL ，有助于除平面结构色素，加入甲酸300μL 以平衡GCB碱性。

16种待测物在相应的线性范围内线性关系良好，r 均大于 0.9900；分别选取绿茶、红茶、黑茶等3种不同基质空白样品加入适量16种真菌毒素混合标准溶液，用与样品相同的分析方法，以信噪比(S/N)为3时对应的加标量计算方法检出限为0.05 μg/kg～5.0 μg/kg，以信噪比(S/N)为10时对应的加标量计算方法定量限为0.15 μg/kg～15.0 μg/kg，结果见表1。

表1 16种真菌毒素在不同茶叶品种中的相关系数、基质效应（ME)与检出限和定量限

化合物	线性范围 (ng/ml)	相关系数ｒ	红茶			黑茶				绿茶
化合物	线性范围 (ng/ml)	相关系数ｒ	LOD (μg/kg)	LOQ (μg/kg)	ME (%)		LOD (μg/kg)	LOQ (μg/kg)	ME (%)		LOD (μg/kg)	LOQ (μg/kg)	ME (%)
DON	1.0～100.0	0.9999	2.0	6.0	25.3		2.0	6.0	19.1		2.0	6.0	14.8
3-ADON	5.0～100.0	0.9996	1.0	3.0	32.0		1.0	3.0	31.6		1.0	3.0	23.7
15-ADON	5.0～100.0	0.9989	1.0	3.0	39.9		1.0	3.0	28.1		1.0	3.0	18.1
NIV	5.0～100.0	0.9997	5.0	15.0	30.9		5.0	15.0	37.9		5.0	15.0	33.3
ZEN	0.5～20.0	0.9990	1.0	3.0	16.2		1.0	3.0	35.6		1.0	3.0	18.9
AFB₁	0.05～2.0	0.9998	0.05	0.15	16.9		0.05	0.15	18.8		0.05	0.15	14.8
AFB₂	0.05～2.0	0.9997	0.1	0.3	19.1		0.1	0.3	32.9		0.1	0.3	23.5
AFG₁	0.05～2.0	0.9993	0.05	0.15	23.2		0.05	0.15	24.1		0.05	0.15	20.5
AFG₂	0.05～2.0	0.9999	0.1	0.3	30.5		0.1	0.3	35.3		0.1	0.3	26.5
FB₁	0.1～4.0	0.9997	0.2	0.6	20.6		0.2	0.6	33.6		0.2	0.6	25.6
FB₂	0.1～4.0	0.9996	0.5	1.5	30.9		0.5	1.5	32.4		0.5	1.5	31.2
FB₃	0.1～4.0	0.9986	0.5	1.5	30.8		0.5	1.5	37.9		0.5	1.5	31.8
OTA	0.05～2.0	0.9992	0.1	0.3	19.7		0.1	0.3	18.9		0.1	0.3	49.0
T-2	0.5～20.0	0.9991	0.2	0.6	65.3		0.2	0.6	69.5		0.2	0.6	70.6
HT-2	1.0～40.0	0.9999	0.2	0.6	28.6		0.2	0.6	33.1		0.2	0.6	29.6
ST	0.05～2.0	0.9992	1.0	3.0	19.5		1.0	3	21.5		1.0	3.0	15.7

串联质谱法测定茶叶中16种真菌毒素 前处理方法的选择及优化

串联质谱法测定茶叶中16种真菌毒素前处理方法的选择及优化