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GST蛋白纯化过程中的常见问题及解决方案
Ins_bf0c01c3
2023/10/30
私聊
生命科学仪器综合讨论
在生物科学领域,蛋白质纯化是一项关键的技术,它对于研究生物分子的结构和功能至关重要。谷胱甘肽
S-
转移酶(
GST
)是一种在许多生物体中发现的蛋白质,它参与了多种生物学过程,包括解毒和细胞保护。在实验室中,我们常常使用
GST
来纯化目标蛋白。然而,在这个过程中,可能会遇到一些常见问题。本文将探讨这些问题,并提出相应的解决方案。
一、目的蛋白结合效率低或不结合
①裂解方式:过分的裂解会使标签蛋白变性,阻止其结合
建议:在裂解过程中调节合适的超声功率和间隔时间或采用温和的机械
/
化学裂解方法。
②缓冲液条件:谷胱甘肽
-
琼脂糖树脂在
pH
值低于
6.5
或高于
8.0
时,结合效率会降低
建议:使用前需用
pH
为
6.5~8.0
的
PBS
进行平衡。
③蛋白发生变性或聚集
建议:使用前需用
pH
为
6.5~8.0
的
PBS
进行平衡。
建议:可在裂解前加入
1-10mM
的
DTT
,在缓冲液中也加入
DTT
;蛋白
-
核酸结合或蛋白
-
蛋白结合可加氯化钠。
④蛋白或脂类在介质中聚集
建议:及时清洗介质或更换新的介质。
⑤上样过程:上样量过载与上样流速过高均会影响
GST
标签蛋白的结合
建议:在上样过程中要注意控制上样量与保持低流速。
⑥
GST
融合蛋白发生聚集沉淀
建议:在裂解
Buffer
和其他缓冲体系中加入
DTT
⑦
GST
融合蛋白被过度稀释
建议:重新浓缩样品,增加蛋白浓度。
二、目的蛋白洗脱不下来或洗脱率低
①洗脱条件
建议:可以通过加大洗脱液体积、降低流速以及延长洗脱液的保留时间等措施提高洗脱效率。
②样品没有经过前处理
建议:样品上柱前必须要经过离心或过滤。
③非特异性吸附
建议:适当选择添加剂降低非特异性吸附。
④洗脱缓冲液中谷胱甘肽被氧化
建议:洗脱缓冲液需现配现用,另外可以尝试加入
1-5mM
的
DTT
。
⑤洗脱蛋白有杂质
GST
融合蛋白被蛋白酶部分降解
建议:加入蛋白酶抑制剂
PMSF
。注:丝氨酸蛋白酶抑制剂必须在使用凝血酶或凝血因子
Xa
前除去。
⑥
GST
融合蛋白被蛋白酶部分降解
建议:使用蛋白酶缺陷型菌株
lon-
或
ompT
,或
ompT
和
lon
双缺陷型菌株。
更多详情可以关注:
GST
标签蛋白纯化
https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/gst-tag-protein-expression
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