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荧光定量PCR曲线向下弯曲的原因及解决方案详解

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2023/11/09

生命科学仪器综合讨论

荧光定量PCR是目前分子生物学研究中最常使用的技术手段之一，但很多初学者在做荧光定量PCR实验时都会遇到一些问题，为了更好地指导研究生的实验教学，结合我们实验室的经验，特将qPCR 常见问题及解决方案总结如下：

①扩增曲线不稳定

可能原因：RNA 纯度低；体系中存在较多杂质；仪器使用时间过长。

解决方案：

提取高纯度的 RNA，小心操作；

对仪器进行校准；

②扩增无法达到平台期

可能原因：模板浓度太低；循环数太少；试剂扩增效率低。

解决方案：

提高模板量；

提高循环数；

用标准曲线测定扩增效率，提高镁离子浓度，换用扩增效率高的试剂。

③荧光下降

可能原因：存在降解；模板浓度过高。

解决方案：

提高体系纯度；

降低模板量；

降低荧光阈值。

④单峰，峰不尖锐

可能原因：与试剂成分有关；或存在大小相近的非特异性扩增。

解决方案：

温度跨度不高于 7 度，视为可用结果；

进行高浓度琼脂糖电泳，确认是否为单一条带。

⑤单峰，Tm 低于 80 度

可能原因：只有引物二聚体，无目的条带；或扩增片段过短。

解决方案：

检查是否加入模板；

进行琼脂糖电泳检测，确定条带大小是否正确。

⑥双峰，较低峰 Tm 在 80 度之前

可能原因：由于模板浓度过低或引物浓度过高使多余引物形成引物二聚体。

解决方案：

适当提高退火温度；

提高模板量，降低引物浓度；

重新设计引物。

⑦严重双峰，Tm 都在 80 度以后

可能原因：引物特异性过差或交叉污染。

解决方案：

BLAST 检查引物特异性，重新设计引物；

在超净台中，换用移液器分别加入引物，避免交叉污染。

⑧其他非正常熔解曲线

可能原因：应体系污染、试剂失效；耗材与仪器不匹配，检测通道不正确；仪器长时间未做矫正。

解决方案：

在无模板洁净区内配制体系；

避免将试剂暴露在强光或高温下；

避免试剂过期；

做好阳性、阴性对照；

选用与仪器匹配的耗材；

定期请工程师进行仪器校准。

⑨标准曲线线性关系不佳

可能原因：加样误差；标准品降解；模板浓度高或有抑制物；引物或探针不佳；PCR 酶灵敏度不高及活力下降。

解决方案：

标准品加样体积大于 2ul、引物预混后再分复孔，定期校正移液器，尽量选择硅化枪头，使用文库稀释液稀释标准品，降低耗材管壁对 DNA 吸附；

避免反复冻融、电泳检测发现降解后重新制备稀释标准品；

改变稀释精度，增加稀释梯度；

更换灵敏度更高，线性关系更好的试剂，校正-20℃冰箱，使用时将酶置于冰上。

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yayicuo

第1楼2023/11/09

应助达人

PCR是热点，荧光定量PCR，要对其进行不确定度评定哟。

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