仪器信息网APP
选仪器、听讲座、看资讯
立即体验
APP内打开
回版面
评论
收藏
点赞
拍砖
举报
取消
发布
当前位置:
仪器社区
>
生命科学仪器
>
生命科学仪器综合讨论
>
帖子详情
蛋白质浓度测定的各种方法及原理
Ins_bf0c01c3
2023/12/15
私聊
生命科学仪器综合讨论
蛋白质浓度测定的各种方法及原理是生物化学和分子生物学实验中的重要环节。蛋白质浓度的准确测定对于研究生物分子相互作用、蛋白质功能和动力学、以及生物样品的分析和鉴定等方面都具有重要的意义。本文将介绍几种常用的蛋白质浓度测定方法及其原理,包括紫外吸收法、微量凯氏定氮法、双缩尿法、
Lowry
法和考马斯亮蓝法等。通过对这些方法的比较和分析,可以更好地了解它们的优缺点,以便根据实际实验需求选择合适的方法来测定蛋白质浓度。
①紫外吸收法
检测原理:
蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共扼双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在
280nm
处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在
238nm
的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,进行蛋白质含量的测定。
方法特点:
优点:简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。
缺点:测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质多。
干扰物:含有嘌呤、嘧啶、核酸等吸收紫外光的物质。
检出限:
50~100ug
蛋白含量。
适用范围:适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
②微量凯氏定氮法
凯氏定氮法被国内外视为蛋白质含量的标准检验方法,可作为衡量其他蛋白质含量检测方法准确性的标准。
实验原理:
样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
方法特点:
优点:通用性强,测定费用低,易实现,仪器简单且测定结果的重复性和重现性好。
缺点:实验耗时长、灵敏度低。
检出限:
0.2~1mg
蛋白含量。
适用范围:凯氏定氮法测的是总蛋白的量,一些非蛋白氮无法检测出。
③双缩尿法
实验原理:
双缩尿(
NH3CONHCONH3
)是两个分子经
180
℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱溶液中,双缩尿与
CuSO4
形成紫色络合物,称为双缩尿反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽链,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩尿反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,与蛋白质分子量及氨基酸成分无关。
方法特点:
优点:适合检测总蛋白质的含量,操作简单、测量速度快。
缺点:标准物质必须使用代表性很强的样品,需使用其他参考方法测出标准物质中的蛋白质总含量,故测定工作费力费时。不宜测定样品种类多、彼此差异大的样品。
检出限:测定蛋白质含量测定范围为
1-20mg
蛋白质。
干扰物:硫酸铵、
Tris
缓冲液和某些氨基酸等。
适用范围:常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。
④
Lowry
法
Lowry
法是双缩脲法的发展,结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应,是最灵敏的蛋白质测定方法之一,在生物化学领域得到广泛的应用,目前分为基本法和改良简易法,改良简易法可获得与基本法相近的结果。
基本法实验原理:
显色原理与双缩尿法相同,但加入了
Folin-
酚酞试剂,以增加显色量,从而提高检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是:①在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。②
Folin
一酚试剂中的磷钼酸盐一磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深兰色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下,兰色深度与蛋白的量成正比。
特点:
优点:灵敏度高。
缺点:耗费时间长,操作时间需精准控制,标准曲线绘制麻烦,专一性较差,干扰物质比较多。
检出限:可检测的最低蛋白质量达
5ug
。通常测定范围是
20~250ug
。
干扰物:酚类、柠檬酸、硫酸铵、
Tris
缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等。
适用范围:除蛋白含量测定,也可用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。
⑤考马斯亮蓝法
实验原理:
考马斯亮蓝
G-250
染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置(
max
),由
465mm
变为
595nm
,溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。经研究认为,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。在
595mm
下测定的吸光度值
A595
,与蛋白质浓度成正比。
方法特点:
优点:灵敏度比
Lowry
高约
4
倍,高效率、检测过程简便、只需要一种试剂,抗干扰能力强。
缺点:测定误差大,不适用于不同蛋白的检测。
检出限:其最低蛋白质检测量可达
1ug
。
干扰物:干扰物质少,但去污剂、
TritonX-100
、十二烷基硫酸钠、
0.1N
的
NaOH
会干扰实验测定。
蛋白质含量测定方法选择
蛋白质含量测定时,考虑以下因素后选定适用的检测方法。
①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;
②蛋白质的性质;
③溶液中存在的干扰物质;
④测定所要花费的时间。
义翘神州提供多种类型的
蛋白资源
,不仅有重组蛋白服务还有各种大咖讲座,详情可以关注
https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review
相关话题
1
超低温实验室探针台不适用液氮罐能用吗
2
美国MVE液氮罐价格趋势与实验室预算合理规划的方法
3
金凤液氮罐使用过程中经常出现的漏氮问题怎么解决?
4
金凤液氮罐价格一览:不同容积和型号的差异与选择建议
5
深入解析蛋白质纯化系统的原理与应用
近期热榜
赛默飞实验室产品焕新计划有奖调研!
【七月征文】不一YOUNG实验“猿”
报名开启:ICS2024第十三届光谱网络会议!
推荐收藏!盘点中药材及饮片检测解决方案
热门活动
甄选国优仪器,助推设备更新
采购咨询618活动:1000元奖励等你拿
猜你喜欢
最新推荐
热门推荐
更多推荐
新型微芯片可快速检测癌细胞
分享
2013/11/22
【有趣呢】科学家称陨星撞击或曾孕育地球早期生命(图)
讨论
2011/10/14
【分享】可生产柴油的菌类!
2008/11/07
【求助】询问蛋白质组学的检测技术有哪些....
2010/01/09
深入了解重组蛋白疫苗:基础原理、优势与局限
资料
2024/01/30
【求助】请教:做好了的酶传感器 用哪些仪器哪些方法检测其性能?
2009/09/08
【原创】移液枪使用注意事项
2010/07/31
[实验室建设] 细胞培养室的建立
分享
2012/02/24
【我们不一YOUNG】蛋白质浓度测定方法大全
原创
2024/07/06
【我们不一YOUNG】HTS酶抑制剂筛选的流程介绍
分享
2024/07/05
太空微重力环境下癌症药物研究系统进口航空航天随机定位微重力模拟仪AJ001X
分享
2024/07/05
弱光成像或体内发光实验Atik TE科研制冷CCD相机
原创
2024/07/05
【我们不一YOUNG】结缘仪器,一起结缘,与仪器信息网一起成长
原创
2024/07/01
心血管检测仪打开后出现ch375dll.dll电脑丢失怎么办
已应助
2024/07/01
出售贝克曼DXC800生化分析系统
原创
2024/06/21
编织袋拉力机
原创
2024/06/14
检测报告一定要有判定结果吗?
求助
2024/07/01
气相FID重现性不好原因
求助
2024/07/01
求助,非甲烷总烃测定中,除烃空气0.4mg/m3,怎么计算的呢?是按总烃计算公式吗?
已应助
2024/06/29
求助安捷伦GC7890B,EPC无响应解决办法
求助
2024/07/01
HJ1332便携非甲实际应用问题
讨论
2024/07/01
衍射斑点标定求助
已应助
2024/06/30
EI源的灯丝镉厂家通用吗?
求助
2024/07/03
‘有奖问答’对错题’:某仪器零件的长度X和质量Y的相关系数为0.68,改进后长度缩短0.2厘米,质量低0.5克,新零件的长度和质量的相关系数为( )
讨论
2024/07/02
认识标准
原创
2023/12/15
主流抗体开发平台:创新技术助力抗体研发
资料
2023/12/15
偶氮前处理实验中需要验收的试剂、耗材有哪些?
已应助
2023/12/15
CMA检测报告的检验检测机构一定要求是合同方吗?
已应助
2023/12/15
一款助眠好帮手
原创
2023/12/15
DT0520隧道二极管探测器HEROTEK
仪器微课堂
2023/12/15
chemstation自定义报告模板如何查看信噪比
已应助
2023/12/15
5009.26-2023N-二甲基亚硝胺
原创
2023/12/15
品牌合作伙伴
岛津
日立科学仪器
珀金埃尔默仪器(上海)有限公司(PerkinElmer)
日本电子株式会社
丹纳赫
安捷伦
赛默飞世尔科技
普析通用
欧波同
天美
天瑞仪器
德国耶拿
海能技术
马尔文帕纳科
磐诺科技
上海仪电科仪
梅特勒托利多
聚光科技
莱伯泰科
盛瀚
多宁生物
丹东百特
科哲
卓立汉光
屹尧科技
华谱科仪
宝德仪器
优莱博
HORIBA
布鲁克核磁
举报帖子
执行举报
点赞用户
好友列表
加载中...
正在为您切换请稍后...