选择将标签融合到目标蛋白的 C 端还是 N 端,很大程度上取决于蛋白本身:蛋白的折叠方式,以及您选择的末端是否有功能要求。例如,如果 C 端在蛋白内部折叠,那么您收到融合蛋白信号的可能性非常小;或者,如果蛋白在标签融合末端进行翻译后剪切,那么标签将从目标蛋白中移除。
如果您有资源或准备开展新型实验,最好同时克隆 C 端和 N 端标签的构造,从而确定最佳选择。一研究小组发现,与 N 端的标签融合蛋白相比, 更多的C端融合蛋白定位于目标亚细胞腔隙。但是,需要强调的是,虽然 C 端标签蛋白的定位和表现往往符合预期,但并不是始终可以预测。融合蛋白定位是否正确,可通过免疫荧光进行检测;免疫印迹有助于确认融合蛋白的大小是否正确并以预期的水平表达,免疫共沉淀有助于评估融合蛋白与已知底物的相互作用方式。