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控制菌检验方法验证

状元秀

2024/06/04

控制菌检验方法验证

建立药品的微生物限度检查时，进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的的控制菌检查方法测定。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检验方法应进行重新验证。验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。

1.1.验证用菌株大肠埃希菌（Esherichia coli）【CMCC(B) 44102】或同等有效的金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus）【CMCC(B)26003】或同等有效的乙型付伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）【CMCC(B) 50094】或同等有效的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）【CMCC (B) 10104】或同等有效的验证实验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0 代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。1.2.菌液制备

大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型付伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至10mL营养肉汤培养基中，35～37℃培养18～24小时；

分别取培养液1mL加0.9%无菌氯化钠溶液，采用10倍递增稀释法，稀释至10^{^-5}~10^{^-7}，制成每1ml含菌数10～100CFU的菌悬液。

1.3. 阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。1.4.试验组常规法

【大肠埃希菌】取相当于1g或1mL供试品的供试液至100mL胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入大肠埃希菌10～100CFU，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌 10～100CFU，35～37℃培养18～24小时，取此培养物按《微生物限度检查SOP》大肠埃希菌项下规定检查。

【大肠菌群】取含适量（不少于10ml）的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别加入含供试品1g或1mL 、0.1g或0.1mL、含供试品0.001g或0.001mL的供试液，阳性菌对照加入大肠埃希菌10～100CFU，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌 10～100CFU，35～37℃培养18～24小时，按《微生物限度检查SOP》大肠菌群项下规定检查。

【沙门菌】取供试品10g或10mL，直接或处理后接种至适量（不少于200mL）的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，阳性菌对照加入沙门菌 10～100CFU，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌10～100CFU，35～37℃培养18～24小时。按《微生物限度检查SOP》沙门菌项下规定检查。

【铜绿假单胞菌】取相当于1g或1mL供试品的供试液至100mL胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入铜绿假单胞菌10～100CFU，阴性菌对照加入大肠埃希菌10～100CFU，35～37℃培养18～24小时。按《微生物限度检查SOP》沙门菌项下规定检查。

【金黄色葡萄球菌】取相当于1g或1mL供试品的供试液至100mL胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入金黄色葡萄球菌10～100CFU，阴性菌对照加入大肠埃希菌 10～100CFU，35～37℃培养18～24小时。按《微生物限度检查SOP》金黄色葡萄球菌项下规定检查。

培养基稀释法供试品有抑菌作用，放大培养基量，由1：100放大到1：300、1：500或1：1000，由于容器体积限制，一般放大到500mL或1000mL，本法适用于抑菌作用不强的样品。薄膜过滤法采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。离心沉淀集菌法

取规定量供试液，如供试液含许多药渣，先以500转/分钟离心3~5分钟，取全部上清液，再以3000转/分离心20分钟，取下面1mL液体，并将适量的稀释剂洗涤管底的洗涤液一并移入同瓶增菌液中，培养，本法适用于中度抑菌作用的样品。

中和法

在供试品溶液中加入相应的中和剂，以减除供试品中抑菌成分的作用，中和剂应对微生物无毒性，与抑菌成分结合后的产物应对微生物亦无毒性，或有毒性但不影响待检菌的检出。

1.5.结果判断至少应进行3次独立平行试验。阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，照该供试液制备方法和控制菌检查法进行该供试品控制菌的检查；若试验组未检出试验菌，应采用自然沉降法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

文章来源：网络/LabPTP能力验证平台

编辑：食品PTP

审核：PTP小赵

封面图片来源：创可贴会员，能力验证小编整理。

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