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标准曲线的绘制

cxdong84

2024/08/28

在标准曲线的制作中，存在这样那样的问题，

比如，常有人问：一定要做5个点？

线性相关系数R值必须几个9才达标？

标曲是每天都做还是每次都做？

标曲是否必须通过原点？本文整理了标准曲线的相关问题，一起来看看吧！

前期测定注意事项：

1、仪器校验好。

2、移取液体体积要精确，保证迅速准确，尽可能用一根移液管；为减小人为误差，同一种液体要一个人操作。

3、保证标准品的纯度，所用标准品最好是新打开的，纯度较高的固体或溶液，防止污染。

4、容器要保证洁净。

5、根据标准品理化性质注意加样的先后顺序。

6、如果要测OD值，应保证测前各管液体充分混匀。

7、若还是有某个点误差较大，应舍弃。

8、样品的浓度等指标是根据标准曲线计算出来的，所以首先要把做标准曲线看作是比做正式实验还要重要的一件事，否则后面的实验结果无从谈起。

9、设置标准曲线样品的标准浓度范围要有一个比较大的跨度，并且要能涵盖你所要检测实验样品的浓度，即样品的浓度要在标准曲线浓度范围之内，包括上限和下限。而对于呈s型的标准曲线，尽量要使实验样品的浓度在中间坡度最陡段，即曲线几乎成直线的范围内。

10、最好采用倍比稀释法配制标准曲线中的标准样品浓度，这样就能够保证标准样品的浓度不会出现较大的偏离。

11、检测标准样品时，应按浓度递增顺序进行，以减少高浓度对低浓度的影响，提高准确性。

12、标准曲线的样品数一般为7个点，但至少要保证有5个点。

13、做出的标准曲线相关系数因实验要求不同而有所变动，但一般来说，相关系数r至少要大于0.98，对于有些实验，至少要0.99甚至是0.999。

分光光度法绘制标准曲线所遇问题

1、单色光纯度不够

问题：标准曲线上端向下弯曲。

措施：光度法中要求在最大吸收峰处测定吸光度，光度计的有效谱带宽度越窄越好，有利于获得纯度高的单色光。

2、比色皿的厚度或光学性能不一致

如果装试剂空白液的比色皿较其它比色皿薄或对光的吸收和反射少一些，则曲线的延线与纵坐标相交；反之，与横坐标相交。

3、显色反应和反应条件的问题

当显色反应的灵敏度不高时，被测物低于某一浓度就不能显色，当浓度不同时，溶液对光的吸收、散射的程度不同，低浓度段往往弯曲，加上浓度高时部分胶体颗粒的聚沉，致使测定的吸光度降低，曲线上端向下弯曲。

4、操作上的原因

问题：褪色反应，显色溶液的颜色不稳定、易褪色，若比色时间超过了稳定时间，标准系列中高浓度溶液颜色减褪，致使曲线上端向下弯曲。

措施：控制好显色剂的加入时间，可以每加3份，停3min，再加上3份，依次进行，以使每支比色管的显色时间相近。

5、干扰物质的影响

标准曲线检验

标准曲线的检验是实际操作中最大的难点，也是工作中误区和争议最多的话题了！

先来了解下最重要的检验项目：

1、精密度检验

标准曲线的精密度检验：精密度检验就是看试验点距离拟合的直线的距离有无异常，所以也称线性检验（拟合检验），需用F检验，P<0.05作为线性检验合格的标准。

2、截距检验&斜率检验

标准曲线的截距检验和斜率检验分别考察Y=a+bX中a和b与0的统计学差异，a与0有差别说明有试剂空白或系统误差，而b若与0没差别说明仪器的灵敏度根本达不到分析要求。

标准曲线的检验应该是线性检验结合失拟检验，以及残差的正态性检验结合才是统计学上比较完备的。

接下来，我们看看实验员在标准曲线使用中还遇到过哪些问题？

问题一：标准曲线需要人为的增加（0.0）吗？

答：不能。通常的标准系列多是配制0,1,2,3mg/L系列这样的说法，没做实验人为添加（0,0）很不妥，因为很多时候0管进入仪器可能也有响应值，这也是我们考察试剂空白的一个重要步骤。这个0管在某些时候非常重要，如，全血铅测定，我们采用牛血清来基体匹配标准系列，如果此时你用酸做空白或没做实验人为添加（0,0），那你就很难做好标准曲线，所以，标准曲线的0管也是做好标准曲线的重要考虑点。

问题二：标准曲线需要减掉试剂空白来做吗？

答：不需要。仪器测出来标准系列的响应值可以减掉试剂空白或减掉0管的响应值来做，工作中我们也常用0管来做仪器调零。其实没有必要那么麻烦，即使空白或0管有响应值，在构建标准曲线时，我们已经认为该响应值就是0浓度，也就是扣除了这个空白的。

问题三：什么时候用Y=kx和二次曲线呢？

答：标准曲线我们通常采用的是Y=a+bX，曲线拟合完必须要做统计检验且要做统计完备的线性检验和失拟检验，然后再做a与0的差别检验，如果a与0的统计学上无差异，你就可以考虑用Y=bX的拟合曲线，拟合出来后同样做线性检验和失拟检验，如果线性检验合格（P<0.05）且失拟检验合格（p>0.05）此时你就可以采用Y=bX。二次曲线的采用同样是这样的道理，如果你Y=a+bX时拟合不合格，你就考虑用Y=a+bX+cX2，同样做失拟检验，考察拟合的符合情况。如果Y=a+bX和Y=a+bX+cX2都满足拟合检验和失拟检验合格，则采用Y=a+bX形式，这样符合统计学上参数最少的统计简洁性原则。

问题四：标准曲线去查含金量事先减空白信号算样品含量还是先算出空白含量相减呢？

答：工作中我们常要减掉空白得到样品含量，现有国家标准方法有的推荐先算出空白含量，用样品含量相减，也有推荐先用样品信号减空白信号然后去标准曲线推算含量。而且这两种算法常常差距很大。其实这种差距往往是低含量水平时才出现，在低含量水平通过标准曲线推算含量时，本身不确定度就很大。这两种方法都可以。个人推荐先用样品信号减空白信号然后去标准曲线推算含量，因为这样出来的含量不确定度要小一些，而先算出空白含量再相减就增加了1次标准曲线推算含量时的不确定度，因为好的测量永远是不确定度小的测量。

要想绘制出合格的标准曲线、使用好标准曲线，真心不易，必须将以上各个方面的条件都考虑进去，即对标准曲线的绘制也实行质量控制，只有这样, 才能得出理想的标准曲线。

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