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高效液相色谱技能篇|关于定性分析的小知识

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2024/09/09

液相色谱（LC）

高效液相色谱（HPLC）中的定性分析是指确定样品中是否存在特定化合物的过程。通常将样品成分的保留时间和峰形与已知标准或参考化合物的保留时间和峰形进行比较。匹配这些保留时间和峰形，可以识别样品中存在的化合物。定量分析用于测量样品中特定化合物的浓度，而定性分析则用于识别和确认这些化合物的身份。

中国药典中对常用的的定性分析阐述了三种，我们现在分别对其概述一下：

01.利用保留时间定性

保留时间（retention time，t_R）定义为被分离组分从进样到柱后出现该组分最大响应值时的时间，也即从进样到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间，常以分钟（min）为时间单位，用于反映被分离的组分在性质上的差异。通常以在相同的色谱条件下待测成分的保留时间与对照品的保留时间是否一致作为待测成分鉴别的依据。在相同的色谱条件下，待测成分的保留时间与对照品的保留时间应无显著性差异；两个保留时间不同的色谱峰归属于不同化合物，但两个保留时间一致的色谱峰有时未必可归属为同一化合物，在作未知物定性分析时应特别注意。若改变流动相组成或更换色谱柱的种类，待测成分的保留时间仍与对照品的保留时间一致，可进一步证实待测成分与对照品为同一化合物。当待测成分（保留时间t_R,1）无对照品时，可以样品中的另一成分或在样品中加入另一成分作为参比物（保留时间t_R,2），采用相对保留时间（RRT）作为定性（或定位）的方法。在品种项下，除另有规定外，相对保留时间通常是指待测成分保留时间相对于主成分保留时间的比值，以未扣除死时间的非调整保留时间按下式计算。 RRT=t_R,1/t_R,2若需以扣除死时间的调整保留时间计算，应在相应的品种项下予以注明。基于保留时间来定性的理解：
1）定义：保留时间=出峰时间，即图谱上峰顶点的时间，以分钟（min）表示；
2）性质差异：保留时间反映了不同组分在色谱过程中与固定相和流动相相互作用的差异。3）对照品比较：在相同的色谱条件下，待测成分的保留时间与对照品的保留时间一致，可以作为初步鉴定待测成分的依据。4）局限性：两个保留时间不同的色谱峰很可能属于不同的化合物，但保留时间相同的色谱峰并不一定是同一化合物，因为不同化合物可能具有相同的保留时间。5）流动相和色谱柱的影响：改变流动相组成或更换色谱柱后，如果待测成分的保留时间仍与对照品一致，这可以提供更强的证据支持待测成分与对照品是同一化合物。6）无对照品时，采用RRT定性：当没有对照品时，可以使用样品中的另一个成分或加入的另一个成分作为参比物，通过计算相对保留时间来进行定性分析。相对保留时间是待测成分的保留时间与参比物保留时间的比值。RRT一般也没有特别明确规定，考虑到仪器自身的波动或者溶剂的挥发影响，有些实验室可能会规定在0.5%~2.5%之间，但具体还是要根据方法本身来确定。液相色谱仪检定规程（JJG705-2002）中提到，定性测量重复性（6次测量）的相对标准偏差（RSD）应不超过1.5%（仅供参考）

02.利用光谱相似度定性

化合物的全波长扫描所得的紫外-可见吸收光谱提供一些有价值的定性信息。待测成分的光谱与对照品的光谱相似程度可用于辅助定性分析。二极管阵列检测器开启一定波长范围的扫描功能时，可以获得更多的信息，包括色谱信号、时间、波长的三维色谱光谱图，既可用于辅助鉴别，还可用于峰纯度分析。

同样应注意，两个光谱不同的色谱峰表征了不同化合物，但两个光谱相似的色谱峰未必可归属为同一化合物。

基于光谱相似度来定性的理解：

1）DAD的原理：使用一组光电二极管同时检测透过样品的所有波长紫外光，而不是某一个或几个波长；对化合物进行检测分析。

2）光谱比较：通过比较待测成分与对照品在特定波长范围内的紫外-可见吸收光谱，可以得到两者光谱的相似度。如果两个光谱相似度足够高，那么可以认为待测成分与对照品是相同的化合物。

3）辅助鉴别：DAD检测器可以提供多种功能，如全光谱扫描、峰纯度检查、光谱库检索等。峰纯度检查是通过分析色谱峰的光谱纯度来确定峰内是否存在杂质。如果一个色谱峰的光谱在整个峰区域内是一致的，那么这个峰被认为是纯的；如果光谱在峰的不同部分有变化，则可能存在杂质。通过这种方法，DAD检测器可以识别和排除样品中的杂质干扰，确保分析结果的准确性。

03.利用质谱检测器提供的质谱信息定性

利用质谱检测器提供的与色谱峰对应化合物的分子质量和结构的信息进行鉴别，相比与仅利用保留时间或保留时间结合光谱相似性进行鉴别，可获得更多的、更可靠的信息，不仅可用于已知物的鉴别，还可提供未知化合物的结构信息（通则 0431）

基于质谱信息来定性的理解：

1）分子质量信息：质谱检测器可以精确测量化合物的分子质量，这对于确定化合物的分子量和分子式至关重要。通过比较样品中化合物的分子质量和已知化合物的分子质量，可以进行准确的定性分析。

2）结构信息：质谱不仅可以提供分子质量信息，还可以通过碎片模式提供化合物结构的信息。化合物在质谱中的裂解模式可以反映其结构特征，通过与标准化合物的质谱图库进行匹配，可以识别未知化合物。

3) 高特异性：与仅使用保留时间或保留时间和光谱相似度结合的方法相比，质谱检测器提供的定性信息更加丰富和可靠。它能够区分同分异构体（具有相同分子式但结构不同的化合物），这对于复杂样品的分析尤为重要。

4) 未知化合物鉴定：质谱检测器不仅可以用于已知化合物的定性分析，还可以通过分析未知化合物的质谱数据，推断其可能的结构。这对于新化合物的发现和复杂样品中未知成分的鉴定非常有价值。

总结一下：

在高效液相色谱分析中，定性分析的关键在于识别样品中的特定化合物。这通常通过三种方法实现：首先，通过比较样品成分与已知标准的保留时间来确定其身份；其次，利用二极管阵列检测器分析紫外-可见光谱，评估样品与标准品的光谱相似度，以此作为辅助鉴定手段；最后，借助质谱检测器提供的分子质量和结构信息，进行更为精确的化合物鉴定。

这些技术的应用，不仅增强了我们对已知化合物的识别能力，也为未知化合物的结构解析提供了重要线索。

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