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【金秋计划】人参皂苷Rg3靶向GRB2恢复线粒体心磷脂稳态预防帕金森病

城头变幻大王骑

2024/09/10

中药/天然药检测

帕金森病（PD）是一种神经退行性疾病，线粒体功能障碍参与帕金森病的发病机制。心磷脂（CL）是线粒体动力学和功能中的关键磷脂，在塑造和维持蛋白质-蛋白质和蛋白质-膜相互作用方面起着关键作用，同时还起着稳定线粒体呼吸链的作用。许多神经系统疾病都与CL异常有关。鉴于 CL、线粒体和神经系统疾病之间存在相关性，保持线粒体CL含量并维持其正常分布的小分子在预防和减轻线粒体损伤方面具有前景。人参皂苷Rg3（Rg3）是一种源自人参的突出生物活性化合物，在多种恶性肿瘤中表现出显著的抗肿瘤功效，并发挥以其抗氧化和抗炎特性为特征的神经保护作用。在临床前模型中，Rg3在鱼藤酮诱导的PD小鼠中表现出运动功能的增强。Rg3的神经保护机制部分涉及其抗氧化特性，以及线粒体通透性过渡孔张口的抑制。然而，Rg3介导其作用的特定蛋白质靶点仍有待阐明。人参皂苷Rg3（Rg3）能够提高心磷脂水平，进而通过增强线粒体未折叠蛋白反应、促进线粒体自噬和增强线粒体氧化磷酸化来促进线粒体稳态，增强酪氨酸羟化酶阳性（TH）多巴胺能神经元的存活率，从而改善了PD小鼠模型中的运动性能。机制上，GRB2蛋白是 Rg3 的直接分子靶标，Rg3促进GRB2和TRKA的互作，增加CRLS1（心磷脂合酶 1）基因表达并促进心磷脂合成。此外，研究还发现富马酸替诺福韦二吡呋酯（TDF）同样可以诱导的GRB2和TRKA之间的增强结合促进CL的合成和恢复线粒体稳态，显示出预防PD的潜力。

1、PD模型中的CL耗竭和线粒体功能障碍作者首先通过体外和体内PD模型中评估了CL水平，发现用A53T-αSyn或MPTP处理的小鼠的SN表现出线粒体CL水平显著降低，转染pCMV3-A53T-αSyn-His的小鼠线粒体CL水平显著较低。此外，用mpp或6-OHDA处理的人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y的线粒体CL水平较低，这些发现表明PD患者的CL水平降低。接着评估PD中的线粒体功能，发现线粒体CL水平降低及导致的线粒体功能障碍在PD的发病机制中起着关键作用

2、Rg3通过GRB2上调CL以提供神经保护接着，作者制定了一种筛选策略，旨在识别能够恢复CL水平的化合物以预防PD。通过10-壬基吖啶橙（NAO）荧光筛选包含包含400多种天然产物的化合物库，发现连翘苷、人参皂苷Rg3、紫云英苷效果最佳。利用秀丽隐杆线虫评估这三种化合物在清除αSyn聚集体中的功效，发现Rg3表现出最显著的效果。此外，Rg3给药促进mitoUPR水平恢复，表明Rg3是一种有效的抗PD化合物，可提高CL水平并维持线粒体稳态。Rg3的功效在哺乳动物神经细胞中也得到证实，且在PD小鼠模型中，Rg3给药阻止了A53T-αSyn诱导的黑质DA神经元的丢失。上述结果结合一些已有报道表明Rg3 通过增强线粒体 CL 水平和维持线粒体稳态来赋予神经保护作用。然而，Rg3控制CL的确切机制尚不清楚。接着作者采用有限蛋白水解法（LiP-SMap）鉴定Rg3的直接靶点，通过FC值和p值筛选确定13 种候选蛋白，通过siRNA在SH-SY5Y 细胞中敲低13个候选基因，发现Rg3对A53T-αSyn诱导的神经损伤的保护作用仅在GRB2沉默后完全消除。线粒体CL的直接定量表明Rg3处理恢复了A53T-αSyn诱导的线粒体CL水平降低，当GRB2沉默时，这种效应消失。接着作者通过CETSA、BLI技术确定Rg3直接与GRB2结合，分子对接预测了结合模式
3、Rg3增强人神经细胞中GRB2与TRKA的相互作用鉴于GRB2直接与NTRK1或TRKA结合对EGFR信号传导至关重要，作者研究了Rg3是否以TRKA或EGFR依赖性方式保护SH-SY5Y细胞。结果显示，用 Rg3 处理促进了GRB2和TRKA之间的互作，且线粒体CL的直接定量显示Rg3处理恢复了A53T-αSyn诱导的线粒体CL水平降低，当TRKA沉默时，这种效应消失。此外，分子对接和SPR分析表明Rg3与GRB2的互作导致TRKA和GRB2之间的结合增强。GRB2与TRKA的细胞内结构域结合，从而启动TRKA激活并促进其磷酸化

4、Rg3诱导人神经细胞中CRLS1表达上调CL通过一系列酶进行合成和代谢。为了确定在维持PD中CL水平方面至关重要的酶，作者采用了RNAi技术来沉默每个候选基因，发现只有敲低CRLS1才能完全消除线虫中的Rg3效应。此外，CRLS1敲低降低CL水平，而在PD模型中，CL补充逆转了这些效应。结果表明，Rg3通过激活CRLS1来提高CL水平，以减轻PD模型中的神经元损失。通过查阅荷兰脑库的数据发现PD患者和对照个体之间的SN中，CRLS1基因的表达显著下降。在细胞模型中同样发现CRLS1 表达显著降低。当CRLS1沉默后，Rg3对A53T-αSyn诱导的神经损伤的保护作用完全消除。此外，Rg3处理增强了 SH-SY5Y 细胞中 CRLS1 的表达，而这些细胞中GRB2或TRKA的敲低减弱了Rg3诱导的表达，表明Rg3通过GRB2和TRKA激活CRLS1表达。进一步研究发现，Rg3激活TRKA-GRB2-ERK-CRLS1通路，协调刺激CL生物合成以维持线粒体稳态

5、Rg3以EVI1依赖性方式介导CRLS1上调为了阐明 CRLS1 转录上调的机制，作者使用TRANSFAC的匹配工具预测了转录因子（TFs）和相关的TF结合位点。在CRLS1的启动子区域中鉴定出4个推定的 TF，使用RNAi技术SH-SY5Y细胞中敲低这些TFs，发现在A53T-αSyn存在的情况下，只有EVI1敲低消除了Rg3的神经保护作用。深入研究表明表明 Rg3 协调 TRKA-GRB2-ERK 通路的激活，最终导致 EVI1 的核易位和 CRLS1 转录的激活

6、Rg3通过Grb2和Crls1缓解A53T-αSyn诱导的运动功能缺陷运动功能障碍是人类患者和小鼠模型中PD的主要病理表现。作者利用两种不同的PD小鼠模型深入探讨了Rg3的保护作用，发现A53T-αSyn 或 MPTP 处理的小鼠在Rg3治疗后运动缺陷显著改善。而在小鼠SN中敲低Grb2或Crls1后，Rg3的神经保护功效完全消失。此外，脂质组学显示Rg3 治疗增加了正常和 A53T-αSyn 诱导的 PD 小鼠 SN 中的 CL 水平，而小鼠SN中Grb2或Crls1的敲低逆转了Rg3对CL水平的影响。这些结果表明Grb2和Crls1在Rg3对小鼠黑质DA神经元的保护作用中起着关键作用
7、Rg3和L-DOPA在缓解A53T-αSyn诱导的运动功能缺陷中的协同作用左旋多巴是临床实践中为PD患者开出的标准药物，鉴于Rg3和L-DOPA之间的作用机制不同，作者假设它们的同时给药可能会产生增强对运动功能障碍和神经退行性变的保护作用。结果显示，左旋多巴单药治疗相比，Rg3和左旋多巴的联合给药在运动功能和神经保护作用方面表现出显著的改善。这些发现表明Rg3和L-DOPA的联合使用代表了一种新颖且有前途的PD临床预防策略

8、靶向TRKA-GRB2-CRLS1轴的TDF增强了CL表达缓解PD症状为了进一步验证TRKA-GRB2轴靶向分子在增强CL表达和改善PD方面的普遍影响，作者采用了表面等离子体共振（SPR）技术筛选与GRB2结合的化合物，鉴定鉴定了11种化合物。其中，TDF和丁酸氯倍他松处理后，暴露于mpp+或6-OHDA的SH-SY5Y细胞存活率增加。TDF是替诺福韦的前药，替诺福韦是一种核苷酸逆转录酶抑制剂，丁酸氯倍他松是专门为眼科类固醇治疗配制的，考虑到其口服给药能力，作者选择了TDF进行进一步研究。结果显示，TDF促进SH-SY5Y 细胞中过表达的A53T-αSyn的清除，并促进GRB2和TRKA之间的互作。此外，TDF处理增强CRLS1表达，并恢复了SH-SY5Y细胞中由A53T-αSyn引起的线粒体CL水平降低。然而，在SH-SY5Y细胞中敲低GRB2或TRKA减弱了TDF诱导的效应。此外，TDF增加了TRKA磷酸化、ERK磷酸化和CRLS1的表达。动物实验显示TDF治疗后后运动能力的损害，以及A53T-αSyn诱导的黑质DA神经元的损失得到缓解（

总结研究通过多个模型的综合筛选和验证，发现人参皂苷Rg3（Rg3）能够提高心磷脂水平。心磷脂水平的这种增加通过增强线粒体未折叠蛋白反应、促进线粒体自噬和增强线粒体氧化磷酸化来促进线粒体稳态，改善了 PD 小鼠模型中的运动性能。通过靶点筛选和验证技术发现GRB2是 Rg3的分子靶标，Rg3 促进 GRB2 和 TRKA之间的相互作用，从而促进 ERK 磷酸化 EVI1，随后增加 CRLS1（心磷脂合酶 1）基因表达并促进心磷脂合成。GRB2 或 CRLS1 的缺失显著减弱了 Rg3 对 PD 症状的有益作用。最后，研究进一步确定了富马酸替诺福韦二吡呋酯（TDF）也促进GRB2和TRKA结合，增强心磷脂表达和恢复线粒体稳态，显示出预防 PD 的有希望的潜力

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