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【金秋计划】葛根素增强SIRT5去琥珀酰化酶活性缓解急性肝损伤后的线粒体氧化应激
城头变幻大王骑
2024/09/10
私聊
中药/天然药检测
对乙酰氨基酚(
APAP
)过量是药物性肝损伤的主要原因。
Sirtuins 5
(
SIRT5
)与各种肝脏疾病的发展有关。然而,其在
APAP
诱发的急性肝损伤(
AILI
)中的作用仍不清楚。
SIRT5
在
AILI
中显著下调,并且
SIRT5
耗竭加剧了体内和体外的线粒体氧化应激。从机制上讲,
SIRT5
在对乙醛脱氢酶
2
(
ALDH2
)的
K385
位点进行去琥珀酰化,从而保持
ALDH2
的酶活性,进而抑制炎症和线粒体氧化应激。此外,
研究发现葛根素(
puerarin
)可促
进
SIRT5
去琥珀酰化酶活性并缓解
AILI
。
1、AILI 中肝细胞SIRT5表达显著下调
作者首先通过RNA测序发现APAP
处理
后,肝脏组织中 SIRT5 表达显著下调。进一步验证SIRT5参与AILI,发现APAP处理的小鼠血清ALT和AST水平均不同程度升高,且q
PCR
、Western blott和免疫组化检测显示APAP处理后肝脏中SIRT5下调,表明SIRT5是AILI发展的关键介质
2
、
SIRT5
改善
APAP
诱导的肝毒性
作者构建了SIRT5-KO小鼠和AAV介导的肝脏特异性SIRT5过表达小鼠,以进一步研究SIRT5在AILI中的作用。结果显示APAP处理后WT小鼠血清ALT和AST水平显著升高,且SIRT5-KO小鼠的血清ALT和AST水平升高更为明显,肝脏坏死显著加重,肝细胞死亡率更高,而SIRT5过表达显著改善APAP引起的肝脏损伤,肝细胞死亡率显著降低,结果表明 SIRT5 可减轻 APAP 诱导的肝毒性
3、SIRT5抑制APAP诱导的肝脏炎症
多项研究表明APAP 引起的肝毒性与炎症密切相关。作者发现接受APAP处理的SIRT5-KO小鼠CD11b和Ly6g阳性炎症细胞数量显著增加,肝脏中炎症细胞因子的水平显著升高,且NF-κB 信号的激活增加,而肝脏特异性SIRT5过表达小鼠则相反,这些结果表明SIRT5可抑制APAP诱导的AILI肝脏炎症
4、SIRT5 抑制AILI 中APAP诱导的线粒体氧化应激
在AILI过程中,细胞色素P450酶产生过量的毒性反应代谢物NAPQI,消耗GSH并与线粒体蛋白共价结合形成APAP加合物,导致线粒体功能障碍、ROS产生和线粒体细胞死亡因子的释放,最终导致肝细胞死亡。作者研究了SIRT5 KO或过表达对APAP诱导的线粒体氧化应激的影响,体内和体外实验结果表明SIRT5抑制了AILI期间的线粒体氧化应激
5、SIRT5缺乏导致AILI中蛋白质琥珀酰化全面增加
鉴于SIRT5在去琥珀酰化中的作用明确,作者采用
LC-MS
/MS分析了APAP处理的WT和SIRT5-KO小鼠肝脏中的琥珀酰化。结果显示共有465种蛋白质中的953个位点表现出差异琥珀酰化,其中359种蛋白质中的802个位点显示琥珀酰化水平增加,而106种蛋白质中的151个位点显示琥珀酰化水平降低,结果表明SIRT5缺陷导致AILI中蛋白质琥珀酰化整体增加,这在体内和体外得到了进一步的验证
6、SIRT5在K385残基处使ALDH2去琥珀酰化
SIRT5缺乏导致参与线粒体氧化应激的关键酶ALDH2的琥珀酰化显著上调。进一步探索SIRT5调控ALDH2琥珀酰化的具体分子机制,免疫荧光发现SIRT5与ALDH2共定位,免疫共沉淀实验表明SIRT5与ALDH2互作,且SIRT5敲除显著上调了体内和体外ALDH2的琥珀酰化水平,但对ALDH2的总蛋白浓度没有影响,相反SIRT5过表达显著降低ALDH2的琥珀酰化水平。进一步检测发现SIRT5缺乏会抑制ALDH2的酶活性,而SIRT5过表达会增加ALDH2的活性。
LC-MS
/MS显示ALDH2中三个位点(K370、K377、K385)琥珀酰化显著增加,其中K370和K385在不同物种中高度保守,作者通过将赖氨酸(K)突变为谷氨酸(E)模拟琥珀酰化,将K突变为精氨酸(R)模拟去琥珀酰化,发现K385是ALDH2上的关键琥珀酰化位点,且K385而非K370的琥珀酰化影响ALDH2的酶活性。此外,SIRT5主要通过对ALDH2在K385残基上的去琥珀酰化来减轻AILI
7、ALDH2在K385残基处的去琥珀酰化可保护小鼠免受 AILI的侵害
为了研究ALDH2-K385去琥珀酰化在AILI中的作用,作者建立了AAV-GFP、AAV-ALDH2-WT和AAV-ALDH2-385K-E过表达转染小鼠,并对其进行APAP处理。结果显示APAP 给药增加ALDH2的琥珀酰化,而ALDH2-385K-E小鼠肝脏中ALDH2的琥珀酰化程度低于ALDH2-WT小鼠。此外,在APAP给药后,ALDH2-385K-E小鼠的转氨酶水平、肝坏死面积和肝细胞死亡增加,线粒体氧化应激和炎症加重。数据表明ALDH2在K385的去琥珀酰化可保护小鼠免受AILI的侵害
8、
K385
位点ALDH2去琥珀酰化介导SIRT5对AILI的保护作用
为了研究SIRT5对ALDH2去琥珀酰化在体内AILI中的作用,作者通过尾静脉注射表达 AAV-GFP、AAV-ALDH2-WT或AAV-ALDH2-385K-E的相关AAV,在SIRT5-KO小鼠中过表达各种形式的ALDH2,这些小鼠随后接受APAP治疗。结果显示SIRT5缺乏显著升高血清转氨酶水平,在APAP处理后引起坏死和肝细胞死亡,而 ALDH2-WT的过表达显著改善了肝损伤。此外,ALDH2-WT小鼠的肝脏氧化和炎症明显减少,但ALDH2-385KE小鼠的肝脏氧化和炎症没有减少,数据表明ALDH2在K385处的去琥珀酰化介导了SIRT5对AILI的保护作用
9、葛根素促进SIRT5减轻AILI
为探究SIRT5激动剂对AILI的治疗作用,作者通过虚拟筛选寻找能与SIRT5结合的天然化合物。根据对接结果筛选出10个亲和能最低的化合物,进一步考察其对SIRT5去琥珀酰化酶活性的影响,其中葛根素对SIRT5去琥珀酰化酶活性的提高最为显著。分子对接分析显示SIRT5能与葛根素结合,分子动力学模拟在原子水平上证实了SIRT5-葛根素复合物的结合稳定性和动力学。接着在体内验证了葛根素对APAP诱导的肝损伤的影响,发现葛根素组在APAP刺激后血清AST和ALT水平降低,肝脏坏死和肝细胞死亡减少,APAP 诱导的氧化应激和炎症明显被抑制。结果表明葛根素通过药理学激活SIRT5减轻AILI,提示葛根素是临床治疗AILI的一种有前途的药物
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