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透过现象看本质——色谱分离条件中几个反常现象的正常解释

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2024/09/16

气相色谱（GC）

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神医给我三条祖传秘方

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又双叒叕分不开了。。。

这是苦逼色谱新人最常遇到的问题。

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每逢此时，就会有老师傅拿出祖传秘方来救命：

秘方一：降温，初始温度降低，升温速率降低

秘方二：降速，柱流速降低，柱压力调小

秘方三：加长，30米柱子分不开就换成60米

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然而，这些祖传秘方真的是万灵神药吗？真的能包治百病吗？

我看不尽然。色谱分离是一个十分复杂的问题，涉及到不同组分与色谱固定相的相互作用力，只有找出作用力的差异才能实现分离。待测物千差万别，固定相多种多样，再加上千变万化的色谱条件，不可能靠几个秘方就解决所有问题。想要手到病除立于不败之地，必须要深入学习分离的基本原理，搞清楚本质才行。

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关于第一条秘方，以前的帖子已经讨论过，温度对分离的影响是多方面的，有时候是低温好，有时候则不是，甚至有时候温度低了反而更差。这个问题必须从分子结构和分子间作用力的角度来讨论。忘记了的同学赶紧复习，请出门左转：

https://bbs.instrument.com.cn/topic/6930845[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱分析中柱温如何选择？——几个反常现象引发的哲学思考（2018.8.11更新完毕）_仪器信息网社区 (instrument.com.cn)[/url]

关于后两条秘方，我们今天来详细的说一说

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长就一定好吗？
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短柱子分不好的，换长柱子肯定会好转，这似乎被认为是理所当然的。长柱子要是不好，为啥会更贵？而且这一条秘方也是被无数的老鸟菜鸟证实过的，起死回生的案例不计其数。而且还会有大神搬出色谱分离方程，从理论上对这一结论进行证明。

色谱分离方程定量的描述了分离度与色谱条件的关系，具体如下：

从这一公式可以看出，分离度与塔板数的平方根成正比，塔板数越多，分离度必然增加。而塔板数是与柱长成正比的，比如一根0.53mm内径的毛细管柱，每米的塔板数约有1000，15米柱就有约1.5万塔板数、30米柱约有3万塔板数、50米柱约有5万塔板数，依此类推。因此可以计算出不同柱长可获得的分离度变化如下图：

一目了然，毋庸置疑，只要不差钱，肯定是买长柱子更好，赶紧找老板要钱去。

等等，别忙。要是长柱子买回来了还是分不开，老板可要发飙的。

看一下这个例子：做白酒分析，用的25米白酒专用柱，柱流速约为5mL/min，柱温程序为50℃保持5min，5℃/min升温至150℃。效果如下

大概是分开了，但是分离度有点低。乙醛/甲醇，正丙醇/乙酸乙酯，乙缩醛/正丁醇，糠醛/己醇/丁酸，四组难分离的峰都是挨在一起勉强分开。于是想着买一根50米柱，加长一倍，肯定问题都解决了。等长柱子买回来，赶紧安上，一切其他条件都不变，一做出来傻眼了

前两组确实明显改善，分离度都到了2以上。但是乙缩醛/正丁醇没啥变化，糠醛/己醇/丁酸三个反而更糟糕了，连在一起完全分不开。

柱子长了反而分不开，为什么会出这种反常现象呢？难道分离度方程都会出错？

分离度方程自然是不会有问题的，毕竟这是色谱学的理论基础之一，一但不成立，整个色谱学都会成为空中楼阁。那么问题出在哪呢？

关键在于我们使用推导结论时没有注意前提条件：分离度方程中有三个方面的变量，只有在容量因子和选择因子都固定的前提下，才能说分离度与塔板数的平方根成正比。反过来说，如果容量因子和选择因子有变化，就不能认为长柱子一定对分离有利。

上面这个例子中，我们使用了程序升温，也就是说分离过程中温度一直在变化，而容量因子和选择因子都会随温度一起变化，柱长不是影响分离的唯一因素。当温度的影响超过柱长的影响时，就出现了反常现象。

我们再次仔细对比两张色谱图，并结合程序升温曲线进行分析。乙醛/甲醇，正丙醇/乙酸乙酯，这两组出峰较早，在初始的恒温阶段就出峰了，也就是说对于长柱和短柱，它们的温度条件没有差异，都是50℃。因此这两组的情况符合规律，柱子加长一倍后，分离度显著提高，近似为原来的根号2倍。但是后两组物质出在升温阶段，而且出峰时对应的温度不相同，此时温度差异就成了影响分离的主导因素。柱子短时，所有物质都出峰比较快，乙缩醛/正丁醇这一组物质在恒温50℃阶段就已经流出，糠醛/己醇/丁酸这一组物质在升温阶段流出，但是流出时对应的温度比较低，约为80~85℃。换成长柱子后，所有物质出峰都变慢，但升温程序没有改变，因此后两组物质流出的温度显著变高了，乙缩醛/正丁醇这一组物质流出时对应的温度升高到60~65℃附近，糠醛/己醇/丁酸这一组物质流出时对应的温度升高到100~105℃附近。根据以前我们讨论过的温度对分子间作用力的影响可以知道，温度升高对这两组物质的分离都有显著的不利影响。也就是说，在这个示例中，其实主要矛盾在于柱温，而柱长不同只是次要矛盾。

以乙缩醛/正丁醇这一组物质为例，乙缩醛与固定相之间以色散力和偶极作用为主，正丁醇由于含有羟基，与固定相之间的作用力除色散力和偶极作用外，还有强烈的氢键作用。氢键的强度随温度升高而显著减小，色散力和偶极作用随温度变化的幅度则要小很多。因此在柱温变化时，乙缩醛的保留能力变化较为平缓，而正丁醇的保留能力变化更加陡峭，二者的变化趋势如下图，在温度低时二者差异大，有利于分离，在温度高时二者差异小，不利于分离。

糠醛/己醇/丁酸这一组物质的情况与上面讲的原理类似。糠醛与固定相的相互作用力以色散力和偶极作用为主，正己醇则多了较强的氢键作用，丁酸含有羧基，氢键作用所占的权重更加明显。相应的，糠醛的保留能力随温度变化较为平缓，而正丁醇和丁酸的保留能力随温度变化较为陡峭，在较高温度时三条线交叉到一起，从而无法分离。

那么要如何改进呢？知道原因就比较简单了：既然是因为样品出来太慢、温度过早的升到了高温，那么让温度程序多等一等就没问题了。于是把初始时间延长到10min，修改后的结果对比如下：

总结：色谱分离中，温度、流速、柱子尺寸等多方面因素是共同起作用的，各个参数互相配合、互相影响。任意改变其中一个，都会牵一发而动全身。因此考虑问题时必须有大局观，“我只改变了xxx，其他都不变”这种想当然的思维是万万要不得的。任何一个微小的改变，就属于改变了原有的方法，那么其他条件也必须配套进行优化。而且在调整参数时一定要从基本原理出发，找到本质原因，而不能简单的停留在表面现象上。看似反常的现象，其实本质还是符合基本规律的，我们要找出主要矛盾，而不能被表面上的次要矛盾蒙蔽。更不要养成一有问题就怪仪器不好、怪柱子不行的坏习惯，选用的条件如果不合适，再好的仪器、再贵的柱子，可能也发挥不出应有的效果。

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该不该降流速？

色谱初学者都喜欢压力高、流速快。为什么？省时间啊，早做完早下班。

但是做多了就会发现，不能太快，太快了分不开，于是只能把流速降下来。有经验的老师傅也经常说，流速低一些，柱效就高一些，分离度会增加。

同样也有色谱大神搬出范迪姆特方程，从理论上对这一结论进行证明。

范迪姆特方程讨论的是柱效与流速的关系，简化的范迪姆特方程包含三个参数，具体如下：

这里面A代表涡流扩散，B代表分子扩散，C代表传质阻力。这三个参数的意义涉及到色谱动力学的速率理论，有点复杂，这里暂且不讨论。我们就当做是三个常数就够了。H代表每一块塔板的高度，柱子长度固定的情况下，H越小则塔板数越多。再结合前面提到的色谱分离方程，塔板数越多则分离度越高。u代表载气线速度，线速度乘以横截面积就是我们平时常见的柱子流速。所以这个方程实际上就是告诉我们什么流速下柱效最高。将这个方程绘制成曲线就更加直观，如下图所示。

范迪姆特曲线有一个最低点，能获得最小塔板高度的线速度叫做最佳线速度，当流速符合这个最佳线速度时具有最高的柱效。而我们实际使用时，为了图省事想快一点，流速通常都非常高，实际线速度远高于最佳线速度，这就导致柱效不高。此时如果将流速降低，柱效就会显著提高，理论上就能提高分离度。

由此可见，降低流速能提高分离度的说法也有充分的理由。

那么，实际情况一定如此吗？有了前一次的经验，聪明人应该就会猜到答案了，不一定。

这里有一个实例：使用30m*0.25mm*0.15um ，DB-17柱测定多环芳烃。按习惯，这种柱子使用氦气流速1mL/min，线速度约为37cm/s，做出来的结果如下图，茚并[1,2,3-cd]芘与二苯并[a,h]蒽这两个刚刚能分离。考虑到氦气的最佳线速度大约是20 cm/s，那么降低流速会不会改善分离效果呢？于是将流速降低到0.6mL/min进行了尝试，然而发现分离效果更差了。

这是怎么回事呢？原因跟前面讨论的情况类似，流速影响柱效是一方面，但是这里是程序升温，还有温度方面的影响没有考虑进去。流速降低之后，目标物出峰变慢，而柱温是程序上升的，出峰慢意味着流出时的温度也升高了。分离效果是柱效和温度两方面共同影响的结果。

实验表明，茚并[1,2,3-cd]芘与二苯并[a,h]蒽这两个物质的保留行为比较特殊，柱温低时二者容易分离，茚并[1,2,3-cd]芘在前、二苯并[a,h]蒽在后，在比较高的温度时二者重叠，温度更高时二者出峰顺序还会颠倒过来（这个问题详见另一篇文章https://bbs.instrument.com.cn/topic/8401875[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/bp]GC-MS分析多环芳烃PAHs的几个问题讨论_仪器信息网社区 (instrument.com.cn)[/url]）。正是因为二者对温度极为敏感，所以温度的影响远超过了柱效的影响，调整流速时首先考虑的不是柱效高低，而是希望目标物在合适的温度出峰。

根据上述分析，要使二者在比较低的柱温下流出才有利于分离，可以采取的措施，一个是降低升温速率，但是这样导致出峰太慢。另一个则是提高流速，让目标物早一点出来，好落在低柱温区。于是将流速提高到2mL/min，改进后分离效果比较满意，而且耗费的时间更少了。

上述情况不是个例，大部分温度影响占主导地位的分离中都会出现类似的反常现象。例如前面提到的白酒分析实例，我们除了可以改变升温程序外，还能通过改变流速来优化分离效果。将柱流速从5mL/min提高到8mL/min，升温速率不变，两组难分离物质的出峰时间显著提前，流出时的温度显著降低。此时虽然损失了一定的柱效，但是由于柱温的影响占主导，较低的温度对这两组物质的分离有利，从而获得了更好的分离效果。修改前后的对比如下：

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总结：与前一节的结论类似，整个分离过程是多方面因素共同决定的，减小流速能提高柱效只是其中一个方面，我们必须综合考虑，分清主要矛盾和次要矛盾，优先考虑主要矛盾，而不能主次颠倒。流速对柱效的影响符合范迪姆特曲线，在一定区间内柱效随流速的变化是比较平缓的，只要不是很高的流速，柱效损失并不严重。而且分离度与柱效的平方根成正比，因此大部分情况下流速对于分离来说都属于次要矛盾。而温度同时影响保留因子和旋转因子，而且选择因子对分离度的影响极为显著，微小的变化都有可能导致本质差异，因此很多时候温度都是分离的主要矛盾。本文在对比讨论时，将程序升温曲线与色谱图叠加在一起分析的做法，也正是为了凸显主要矛盾。

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最后还要注意，本文写作的目的是希望大家能够从基本原理出发来分析讨论问题，把问题的本质弄清楚，而不要寄希望于几个口诀秘方解决问题。因此千万不要对本文的结论死记硬背，而要理解思考问题的方法。死记硬背就又会陷入教条主义和经验主义的误区。以上讨论，你我共勉。

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yifan1117

第1楼2024/09/16

牛，恍然大悟呀。

0

zyl3367898

第2楼2024/09/16

应助达人

讲得很好，以后就按照这个思路来试试。

0

wazcq

第3楼2024/09/17

应助达人

总结的很好图片也很清楚

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