实时定量pcr的原理

实时定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，简称RT-qPCR或qPCR）是一种分子生物学技术，它允许研究人员在PCR（聚合酶链反应）扩增过程中实时监测DNA的数量变化，从而对起始模板DNA的数量进行精确的定量分析。实时定量PCR不仅能够检测目标核酸的存在与否，还能提供关于起始样本中目标核酸绝对或相对数量的信息。

实时定量PCR的基本原理包括以下几个关键部分：

1. **荧光标记**：实时定量PCR利用荧光信号的变化来监测PCR过程中特定DNA序列的指数级增加。荧光信号与PCR产物的量成正比，因此可以通过监测荧光强度来跟踪PCR反应的进程。

2. **荧光染料或探针**：
- **SYBR Green I**：这是一种非特异性染料，可以结合任何双链DNA，适用于没有严格特异性要求的情况。
- **TaqMan 探针**：这是一种报告探针，它结合了特定的DNA序列，在PCR扩增过程中通过荧光共振能量转移（FRET）机制产生荧光信号。
- **Molecular Beacons**：分子灯塔是一种特殊的探针，它在未结合状态下形成发夹结构，不发出荧光；当与目标序列结合后打开发夹，发出荧光信号。

3. **扩增循环**：PCR过程包括三个基本步骤——变性（denaturation）、退火（annealing）和延伸（extension），这三个步骤在一个循环中重复进行。随着循环次数的增加，目标DNA片段的数量呈指数增长。

4. **阈值循环数 (Ct 值)**：实时定量PCR通过计算到达预设阈值所需的循环次数（即Ct值）来定量目标DNA。Ct值与起始模板的量成反比，即起始模板越多，到达阈值所需的循环数就越少。

5. **数据分析**：通过对不同样本的Ct值进行比较，可以得出相对定量结果。也可以通过构建标准曲线来确定绝对定量。

实时定量PCR技术因其高灵敏度、特异性强以及快速的特点，在基因表达分析、病原体检测、遗传变异分析、癌症研究等多个领域有着广泛的应用。