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免疫荧光protocol和细胞台盼蓝染色计数实验操作步骤
Ins_564515b5
2024/10/08
私聊
前处理综合讨论
免疫荧光
1.
固定:
4%
多聚甲醛
500ul/
孔,室温固定
30min
;
2.
酸处理:吸出
4%
多聚甲醛,用
PBS
润洗一遍,加入含
2mol/L HCl
的
PBS
溶液
500ul/
孔,室温
1h
(此步骤仅
BrdU
需要);
3.
透膜:吸出
HCl,
加入透膜液
500ul/
孔,
37
℃
,
1h
;
4.
封闭:封闭液(
1%BSA,5‰tritonX-100
的
PBS
溶液)室温,
1h
;
5.
一抗过夜:一抗:封闭液=
3ul
:
500ul,4
℃
过夜;
6.
一抗回收:
EP
管
4
℃
保存;
7.
一抗清洗:清洗液(
1‰ TWEEN20,0.1‰tritonX-100
的
PBS
溶液)
500ul/
孔,
37
℃
,
120rpm, 5min x 3
;
8.
二抗孵育:二抗:清洗液=
1
:
200
0
,
预混,避光,
37
℃
,
1
5
0rpm, 5min
;
9.
二抗清洗:同一抗;
10.DAPI
染色:
DAPI
:清洗液=
1
:
100
, 37
℃
,
10 min
;
11.DAPI
清洗:同一抗;
12.
封片:擦净载玻片,滴上
1
滴抗抗荧光淬灭剂,吸净孔板里的液体,取出爬片倒放在载玻片上,中性树脂封片,待树脂干后可置于导航仪上观察;
13.
观察后切片置于切片盒,
4
℃
保存。
贴壁细胞:
直接将细胞接种于爬片上,待细胞长至合适密度进行免疫荧光。
悬浮细胞
:
提前用
500ul 1%PDL
处理爬片(
37
℃,
30min
)
,
然后在细胞传代重悬后取
30
万细胞
/400ul
培养基接种于每张爬片上,细胞培养箱中放置
2h
后进行免疫荧光实验。
●
台盼蓝染色
一.
实验原理:细胞损伤或死亡时,台盼蓝染料可以穿过变形的细胞膜与
解体
的
DNA结合,使其着色。而活细胞能阻止这类染料进入细胞内。
二.
实验步骤:
1.
用
75%酒精擦干净计数板,放于超净台内;
2.
准备稀释好的细胞悬液,取
90ul于EP管;
3.
取
10ul0.4%台盼蓝加入EP管
(此时台盼蓝浓度为
0.04%);
4.
用
100ul枪吹散混匀台盼蓝与细胞悬液;
5.
取
10ul加入计数板;
6.
10X镜下数细胞总数以及
台盼蓝蓝染
的细胞数;
7.
计算:细胞活性
=(
1-台盼蓝蓝染的
细胞个数
/细胞总数)X100%;
三.
注意
台盼蓝染色
后,应迅速进行细胞计数,不超过
3min,
否则部分活细胞也会着色,从而干扰计数,影响实验的准确性;
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