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(琼脂)平板克隆斑实验
Ins_564515b5
2024/10/09
私聊
前处理综合讨论
一、
概念
:
细胞克隆形成率
即细胞接种存活率,表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆,而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
二、实验步骤
:
1、取对数生长期的各组细胞,分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。
2、将细胞悬液作梯度倍数稀释,每组细胞分别以每孔50、100、200个细胞的梯度密度分别接种于含2mL的培养液的6孔板中,并轻轻摇晃,使细胞分散均匀。
(若细胞贴壁性好,增殖过程中不会生成部分悬浮细胞,可直接到步骤
4)
3、待37℃孵育2h后,镜下可观察到细胞已经悉数贴壁,此时将6孔板中培养基换做含0.2% agar 的完全培养液。
4、置于培养箱中培养10-14天。(注意: 细胞培养时间视细胞而定,生长缓慢的细胞,可以适当延长培养天数.)
5、经常观察,当6孔板中出现肉眼可见的克隆时,一般为14天左右,最少不能低于10天,终止培养。弃去上清液,用PBS小心浸洗2次(可沿着侧壁缓慢加入,避免吹掉细胞)。加5mL冰甲醇固定细胞20分钟。然后去固定液,PBS小心浸洗1次,再加2ml苏木素染色5分钟,然后用流水缓慢洗去苏木素,空气干燥。
6、将6孔板倒置,并用记号笔在地面画出九宫格网格,用肉眼直接计数克隆球,或在显微镜(低倍镜)计数大于50个细胞的克隆球数。最后计算克隆形成率。
克隆形成率
=(克隆数/接种细胞数)×100%
注意事项
:
1.平板克隆形成试验方法简单,适用于贴壁生长的细胞。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好,不能有细胞团,接种密度不能过大。
2.
克隆球计数时
,要求每个克隆球之间有一定的间隔,每个克隆球要求为明显独立的克隆球。
附
:含0.2%agar 培养液配制:
1、琼脂准备:50ml超纯水于三角瓶(已消毒)内溶解0.5g琼脂粉(1%琼脂溶液),置于微波炉中加热,约2min可完全溶解,注意防止琼脂溢出;
2、用温度计测量琼脂溶液的温度,至40℃左右,6孔板每孔按1.6ml 培养基+400ul 琼脂溶液的比例添加(琼脂浓度0.2%),漩涡震荡仪快速震荡后将孔内培养基换成含0.2% agar的培养基。为防止琼脂凝固,整个过程要快。
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