摘要 ：本实验重现了 GB/T 19857-2005 中的前处理方法，采用 Cleanert ® Alumina-N 小柱结合液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）对鱼肉中孔雀石绿和结晶紫进行了测定。样品经乙腈提取，Cleanert ®Alumina-N 小柱净化，LC-MS/MS 进行检测，以 0.1%甲酸水和乙腈为流动相进行梯度洗脱，内标法定量。结果表明，当加标量为 2.5 µg/kg 时，回收率在 90% ~ 115%之间，能够满足检测要求。
关键词 ：孔雀石绿；结晶紫；Cleanert ® Alumina-N；LC-MS/MS；鱼肉
前言
孔雀石绿是人工合成的有机化合物。其生产是由 1 摩尔分子的苯甲醛（Benzaldehyde）和 2 摩尔分子的二甲苯胺在浓盐酸混合下，加热缩合成隐色素碱（Leuco base），在酸性条件下加过氧化铅使其氧化，并在碱性液中沉淀出色素碱。它属于三苯甲烷型的绿色染料。孔雀石绿是有毒的三苯甲烷类化学物，既是染料，也是杀真菌、杀细菌、杀寄生虫的药物，长期超量使用可致癌，无公害水产养殖领域国家明令禁止添加。
本文通过对国标方法的重现，建立了鱼肉中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫同时测定的分析方法。
实验部分
仪器、试剂与材料
主要仪器设备
AB SCEIX API 4000 + 液相色谱串联质谱仪。
试剂材料
乙腈为色谱纯；实验用水为超纯水；乙酸铵为分析纯；
孔雀石绿、结晶紫混合标准工作溶液：孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫，乙腈溶解；
内标标准溶液：氘代孔雀石绿、氘代隐色孔雀石绿，2 ng/mL，乙腈︰5 mmol/L 乙
酸铵溶液=1︰1（V/V）溶解；
Cleanert ® Alumina N 固相萃取小柱：1000 mg/3 mL。
样品制备
样品提取
称取均质好的鱼肉样品 5 g 置于 50 mL 离心管中，加入 200 µL 2 ng/mL 的内标标准溶液，再加入 11 mL 乙腈，超声提取 2 min，8000 r/min 匀浆 30 s，4000 r/min 离心 5min，取全部上清液置于 25 mL 比色管中，取另一离心管加入 11 mL 乙腈洗涤匀浆刀头10 s，合并于装有样品残渣的离心管中，残渣用玻璃棒捣碎，涡旋 30 s，超声振荡 5 min，4000 r/min 离心 5 min，合并两次上清液，用乙腈定容至 25 mL，摇匀，待净化。
样品净化
将 Cleanert ® Alumina-N 小柱用 5 mL 乙腈活化，从上述待净化液中取出 5 mL 上样于小柱上，收集流出液于 KD 浓缩瓶中，再用 4 mL 乙腈洗涤小柱，收集流出液于同一KD 浓缩瓶中，将流出液于 45℃旋蒸至小于 1 mL，用乙腈定容至 1 mL，超声振荡 5 min，加入 1 mL 5 mmol/L 乙酸铵溶液，超声振荡 1 min，经 0.22 µm 尼龙针式过滤器过滤，待检测。
以上操作可用卓睿全自动固相萃取仪完成。
实验条件
色谱条件
色谱柱：Venusil MP C18，3 µm，100 Å，3.0 × 50 mm
流动相：A相-0.1%甲酸水溶液（V/V），B相-乙腈
柱 温：30℃
进样量：5 µL
梯度洗脱条件(见表1)
质谱条件
离子源：ESI+；电喷雾电压：5500 V；雾化气压力：50 psi；气帘气压力：25 psi；
辅助气压力：50 psi；离子源温度：500℃；采集方式：多反应监测(MRM)。
结果与讨论
由表 3 可知，使用 Cleanert ® Alumina-N 固相萃取小柱处理鱼肉基质，并结合LC-MS/MS 检测鱼肉中的孔雀石绿与结晶紫，加标回收率在 90% ~ 115%之间，且变异系数小于 10%，能够满足检测要求。由图 1 可知，用 Venusil MP C18 色谱柱分离孔雀石绿与结晶紫，分离效果良好。
结论
本实验建立了鱼肉中孔雀石绿与结晶紫的前处理方法，并结合 LC-MS/MS 对样品进行了检测。结果表明，对于加标量为 2.5 µg/kg 的鱼肉样品，加标回收率在 90% ~ 115%之间，且变异系数小于 10%，满足检测要求。说明该方法适用于鱼肉中孔雀石绿与结晶紫的检测。
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