摘要:本实验采用异硫氰酸苯酯(PITC)为衍生剂,并在衍生过程中加入二巯基二丙酸(MPA)保护半胱氨酸。同时采用反向高效液相色谱法,以正亮氨酸为内标物,使用 Venusil ○R AA 氨基酸分析方法包,分析复方氨基酸注射液样品中氨基酸组成。本方法快速、灵敏、准确,特别适用于同时含有胱氨酸和半胱氨酸的多肽氨基酸组成的测定。
关键词:高效液相色谱法;异硫氰酸苯酯(PITC);复方氨基酸注射液; Venusil ○R AA ;胱氨酸;半胱氨酸
前言
氨基酸是生物体中重要的生命物质,是组成酶和蛋白质的基本单元。作为小分子,氨基酸对生物大分子的活性及其生理功能起着极为重要的作用;作为配体,它可与多种金属离子配位,为研究抗肿瘤、抗癌药物提供信息。各种氨基酸在生物体中具有不同的生物功能,因此,准确灵敏地测定食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要的意义。
本实验采用Venusil ○R AA氨基酸分析方法包中的检测标准,使用Venusil ○ R AA氨基酸分析专用柱对复方氨基酸注射液中的氨基酸组成进行了测试。
实验部分
仪器、试剂与材料
试剂材料
流动相 A:称取 15.2 g 无水醋酸钠,加水 1850 mL 溶解,用冰醋酸调节 pH 至 6.5,
然后加入乙腈 140 mL,混匀;
流动相 B:乙腈 ︰ 水=80 ︰ 20;
稀盐酸:0.1 mol/L 盐酸;
二疏基二丙酸(MPA)溶液:取 MPA 约 8.0 mg,加入 200 mol/LNaOH 溶液 1mL 溶解;
内标溶液:称取正亮氨酸 10 mg,置于 10 mL 容量瓶中,加稀盐酸溶解并定容至刻度;
色氨酸:称取色氨酸 10 mg,置于 10 mL 容量瓶中,加稀盐酸溶解并定容至刻度;
三乙胺乙腈溶液:取 Venusil ○R AA 氨基酸分析方法包中三乙胺一瓶,加乙腈 8.6 mL,混匀;
异硫氰酸苯酯乙腈溶液:取 Venusil ○R AA 氨基酸分析方法包中异硫氰酸苯酯溶液 1瓶,加乙腈 2.0 mL,混匀;
氨基酸标准溶液:取 Venusil ○R AA 氨基酸分析方法包中 17 种氨基酸标准溶液(包括门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、赖氨酸)1.0 mL,加色氨酸溶液 0.5 mL,稀盐酸 3.5 mL 稀释,混匀;
复方氨基酸注射液样品:无色透明液体,由某医药科技公司提供。
样品制备
移取复方氨基酸注射液样品 1.0 mL,置于 50 mL 离心管中,加入稀盐酸 30 mL,混匀,作为样品溶液,待衍生使用。
氨基酸标准溶液和样品溶液的衍生
取 18 种氨基酸标准溶液(含色氨酸 2.5 μmol/mL)、上述复方氨基酸样品溶液各 200μL,分别置于 1.5 mL 离心管中,向每个离心管中加入 MPA 溶液 40 μL,再向每个离心管中加入内标溶液 20 μL,混匀,然后依次向每个离心管中加入三乙胺乙腈溶液 100μL,异硫氰酸苯酯乙腈溶液 100 μL,混匀,室温放置 1 小时。再向每个离心管中加入400 μL 正己烷,振摇后放置 10 min,取下层溶液 200 μL,加 800 μL 水稀释,经 0.45 μm针筒过滤器过滤,取续滤液作为样品试液。
色谱条件
色谱柱:Venusil ○
R AA;5 μm;4.6 × 250 mm;
流 速:1.0 mL/min;
柱 温:40 ℃;
波 长:254 nm;
进样量:10 μL;
梯 度:
结果与讨论
本实验采用Venusil ○R AA氨基酸分析方法包对复方氨基酸注射液中氨基酸进行了测试,由表 2 及图 2 可知,使用 Venusil ○R AA 氨基酸分析方法包共检测出复方氨基酸注射液中 17 种氨基酸,各氨基酸峰间的分离效果较好。
结论
根据实验结果,使用 Venusil ○R AA 氨基酸分析方法包共检测出复方氨基酸注射液中17 种氨基酸,各氨基酸峰间的分离效果较好,能够满足检测要求。
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