摘要:本实验采用目前广泛使用的以OPA(邻苯二甲醛)和FMOC(9-芴基甲基氯甲酸盐)为衍生剂的柱
前衍生HPLC氨基酸分析方法,同时采用反相高效液相色谱法,以正缬氨酸为内标物,使用 Durashell
AA 氨基酸分析方法包,分析土鳖虫微粉中游离氨基酸。本方法快速、灵敏、准确、无需要手工衍
生,可全自动化在线分析、衍生试剂无毒、无臭等优点。
关键词:高效液相色谱法;OPA(邻苯二甲醛);FMOC(9-芴基甲基氯甲酸盐);土鳖虫微粉;Durashell
AA;氨基酸
前言
氨基酸是生物体中重要的生命物质,是组成酶和蛋白质的基本单元。作为小分子,
氨基酸对生物大分子的活性及其生理功能起着极为重要的作用;作为配体,它可与多种
金属离子配位,为研究抗肿瘤、抗癌药物提供信息。各种氨基酸在生物体中具有不同的
生物功能,因此,准确灵敏地测定食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要
的意义。
本实验采用Durashell AA氨基酸分析方法包中的检测标准,使用Durashell AA氨基
酸分析专用柱对土鳖虫微粉中游离氨基酸进行测试。
实验部分
仪器、试剂与材料
试剂材料
流动相 A:称取十二水合磷酸氢二钠 7.2 g,十水合四硼酸钠 7.6 g,加水 2000 mL,
用盐酸(约 3.0 mL)调节 PH 至 8.2,用 0.45μm 滤膜过滤;
流动相 B:取甲醇 450 mL,乙腈 450 mL,水 100 mL,混匀,超声脱气;
稀盐酸:取 36%盐酸 4.16 mL,加水稀释至 500 mL;
衍生试剂(OPA):取 Durashell AA 氨基酸分析方法包中 OPA-A 试剂 1 支,加入
OPA-B 试剂 60 µL,混匀,即得;
稀释剂:取 100 mL 流动相 A,加磷酸 0.5 mL,混匀;
混合氨基酸对照品:(L-门冬氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-
精氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、氯化铵、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、
L-是色氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸浓度为 2.5 μmol/mL, L-
胱氨酸浓度为 1.25 μmol/mL);
土鳖虫微粉:褐色粉末,由某药科大学提供。
样品制备
衍生用混合氨基酸标准溶液:准确量取氨基酸分析方法组件包中的氨基酸标准溶液
100 μL,置于 2 mL 样品瓶中,准确加入内标溶液 50 μL, 0.1 mol/L 盐酸溶液 400 μL,
混匀,作为衍生用混合氨基酸标准溶液;
衍生用土鳖虫微粉样品溶液:准确称取样品 0.5 g,加乙腈/水=50/50(v/v)25 mL,
混匀,超声处理 30 min,经 0.45 μm 针筒过滤器过滤,取续滤液作为样品试液,准确量
取样品溶液 500 μL,置于 2.0 mL 样品瓶中,准确加入内标溶液 50 μL,混匀,作为衍
生用样品溶液。
色谱条件
色谱柱:Durashell AA;3 μm;4.6 × 150 mm;
柱 温:45℃;
波 长:338 nm(22 min 切换波长为 262 nm);
进样量:2 μL;
衍生程序:Durashell AA 氨基酸分析方法包中氨基酸衍生程序;
梯 度:
表 1.液相色谱梯度洗脱条件
结果与讨论
本实验采用 Durashell AA 氨基酸分析方法包对土鳖虫微粉中氨基酸进行了测试,
由图 2 可知,使用 Durashell AA 氨基酸分析方法包共检测出土鳖虫微粉中 17 种游离氨
基酸,各氨基酸峰间的分离效果较好。
图 1. 19 种混合氨基酸对照溶液高效液相色谱图
按出峰顺序依次为:门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨
酸、缬氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸(内标)、色氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、铵离子、脯氨酸。
图 2. 土鳖虫微粉样品溶液高效液相色谱图
按出峰顺序依次为:门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨
酸、缬氨酸、正缬氨酸(内标)、色氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、铵离子、脯氨酸。
结论
根据实验结果,使用 Durashell AA 氨基酸分析方法包共检测出土鳖虫微粉样品中
17 种游离氨基酸,各氨基酸峰间的分离效果较好,能够满足检测要求。
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