Chem Eng J (IF=16.7) 工程化鹿茸干细胞外泌体的抗肿瘤功效

瑞芯智造（深圳）科技有限公司

2024/09/25 13:40

外泌体是由不同细胞分泌的纳米大小的囊泡，在细胞内通讯和物质转运中发挥重要作用。由于其独特的结构和组成特征，外泌体具有优异的生物相容性，源自不同细胞的外泌体继承了亲本细胞的天然生物学特征，具有低免疫原性和克服生物屏障的能力，已被广泛用作肿瘤治疗的天然药物和递送载体。然而，大多数外泌体由于靶向效率低、治疗效果不理想、产量低等挑战，限制了其应用。探索具有多功能且强大的生物学功能的外泌体并对其进行工程改造以提高治疗效果势在必行。

鹿茸干细胞 (Antler stem cells, ASCs) 在鹿茸的生长和再生中发挥着至关重要的作用，使鹿茸成为哺乳动物中唯一能在每年完全更新的器官。它们显示了胚胎干细胞 (ESC) 和间充质干细胞 (MSC) 的两种特性。与人骨髓干细胞等其他类型干细胞相比，ASCs具有明显更高的自我更新和增殖能力，有利于鹿茸的快速生长和再生。鹿茸可以每天2.75 厘米的速度在 3 个月内质量长至 15 公斤，长度达 120 厘米。因为可能通过自然选择进化出了低效的癌症防御机制，尽管鹿茸生长得很快，但却可以避免癌症的生长。抑癌基因和原癌基因均参与鹿茸的生长。其中高表达的原癌基因促使鹿茸快速的生长，而这种快速生长也受到如TP53等抑癌基因的严格控制，从而抑制肿瘤的生长。因此，鹿角几乎不会发生癌变！此外，鹿角提取物已被证明可以在体外通过抑制肿瘤细胞增殖或集落形成以及促进肿瘤细胞凋亡来抗癌。特别是在之前的研究中发现ASCs条件培养基可以抑制肿瘤细胞的增殖并上调肿瘤细胞表达细胞凋亡相关蛋白，而外泌体是条件培养基中的重要活性成分。此外，鹿角可以每年再生，ASCs容易获得，并且ASCs衍生的外泌体可以大规模生产，这克服了人类干细胞外泌体稀缺的限制。因此，ASCs外泌体具有抗肿瘤潜力和大规模生产的特性，将成为构建癌症治疗系统的有利候选。

就在2024新年的第一天，中国农业科学院特产研究所彭英华研究员团队在Chemical Engineering Journal期刊（IF=16.7）上发表题为“工程化鹿茸干细胞外泌体通过重组免疫抑制性肿瘤微环境增强免疫检查点抑制物的抗肿瘤功效”的文章。这项研究中，作者构建了鹿茸工程外泌体，称为M2Pep-Exo(pIC)，是通过在ASCs外泌体表面用M2巨噬细胞靶向肽 (M2Pep) 修饰，并将Toll样受体 3 (TLR3) 激动剂poly(I:C) 包装其内开发而成，用于增强肿瘤免疫治疗。由于鹿茸的肿瘤抗性和年度生长的特点而易于获取，源自 ASCs 的外泌体作为天然纳米载体具有抑制肿瘤生长的巨大潜力。M2Pep-Exo(pIC)在肿瘤组织中实现了更好的富集，并可以通过使肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 的重极化和促进树突状细胞 (DCs) 的生长来增强机体抗肿瘤免疫反应。导致肿瘤部位的细胞毒性 CD8+ T 细胞浸润增加，从而实现有效的抗肿瘤治疗。此外，M2Pep-Exo(pIC) 与PD-L1抗体的组合不仅可以阻止原发肿瘤的进程，还可以抑制肿瘤的转移。这些发现强调了通过重塑免疫抑制性肿瘤微环境 (TME) 来增强PD-L1检查点屏障活性的一种极具前景的方法，从而实现实体瘤更大效果的免疫治疗。

鹿茸干细胞的分离和表征

ASCs是从梅花鹿鹿茸的中干细胞层中分离而来。倒置显微镜下观察，ASCs贴在培养皿上，呈长梭形漩涡状排列，与MSCs特征形态一致。流式细胞术和免疫荧光分析的数据显示，ASCs表达MSCs标志蛋白CD44和CD90，且CD44和CD90的阳性率均超过98%（图1A和B），确认其为 MSCs。此外，ASC还具有脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞三系分化的能力。

M2Pep-Exo(pIC) 的合成与表征

M2Pep-Exo(pIC)合成示意图如图2所示。首先，通过超速离心法从ASCs培养上清液中分离出Exo外泌体。然后，通过 DSPE-PEG-M2Pep 和 Exo 的简单共孵育制备 M2Pep-Exo，其中 DSPE-PEG-M2Pep 包含烷基链会自动锚定到外泌体膜上的脂筏上。随后，通过超声处理的方法将poly(I:C) 封装到M2Pep-Exo中，构建M2Pep-Exo(pIC)。封装的poly(I:C) 进一步增强了M2-TAM的重极化潜力，同时促进了DCs的成熟。Exo、M2Pep-Exo 和 M2Pep-Exo(pIC) 在透射电镜图像上均表现出明显的杯状和双层膜囊泡（图 1）。在所有亲本外泌体和工程外泌体中观察到的形态和结构相似性证明，M2Pep的修饰和 pIC 的封装对外泌体的形态和完整性没有明显的影响。

通过NanoCoulter纳米库尔特颗粒分析仪测定了各囊泡的大小。 Exo、M2Pep-Exo 和 M2Pep Exo(pIC) 的平均尺寸分别为 66.0 nm、71.0 nm 和 85.0 nm（图 1）。修饰后的外泌体的尺寸与典型的外泌体尺寸保持一致。由于 pIC 的加载，M2Pep-Exo(pIC)比 Exo 和 M2Pep-Exo 表现出更大的尺寸。Western Blot证实了所有样本中均存在外泌体标记蛋白（Alix、TSG101和CD81），也证明外泌体已成功从ASC中分离出来并且经过M2Pep修饰和PICC封装后，外泌体的完整性并未被破坏。此外，如图1K 展示了Exo 的负电荷特性（zeta 电位为 –22.0 ± 4.2 mV，其稳定性将延长血液循环，有助于下游生物学应用；由于 Exo膜和 M2Pep 的结合，M2Pep-Exo 的 zeta 电位从降至至 – 11.0 ± 2.8 mV；相比之下封装在囊泡内的poly(I:C)并不改变M2Pep-Exo(pIC) 的表面 zeta 电位 (-13.0 ± 2.8 mV)。以上单颗粒电位的定量检测均来自于NanoCoulter纳米库尔特颗粒分析仪的zeta电位功能。

图1. ASCs 的鉴定以及 Exo、M2Pep-Exo 和 M2Pep-Exo(pIC) 的表征。(A, B) 通过流式细胞术和免疫荧光染色鉴定ASCs表面标志蛋白 (CD44 和CD90) 的表达；分别通过 TEM 检测 Exo、M2Pep-Exo 和 M2Pep-Exo(pIC) 的形态 (C-E) ，通过NanoCoulter颗粒分析仪外泌体的尺寸分布 (F-H)；(I) 通过纳米流式细胞术检测Exo、M2Pe p-Exo 和M2Pep -Exo(pIC)的平均大小；(J) 通过Western Blot分析外泌体特异性蛋白（Alix、TSG101 和 CD81）的表达。(K) NanoCoulter颗粒分析仪测试 Exo、M2Pep-Exo 和 M2Pep-Exo(pIC)的 zeta 电位。

M2Pep-Exo 体外靶向

肿瘤靶向是构建有效的药物递送系统来提高疗效不可或缺的前提。作者将Raw 264.7细胞与4T1细胞在transwell系统中共培养从而在体外模拟M2-TAM，并用荧光染料DiI 标记各外泌体样本用于细胞摄取的可视化。结果显示（图略），Exo 和 M2Pep-Exo 均表现出明显的被两种巨噬细胞内化的能力，然而M2Pep-Exo比单独的Exo更有效地内化为M2-TAM，表现为更强的红色荧光和M2-TAMs 组中 M2Pep-Exo平均荧光强度的增加。这种现象通过流式细胞术进一步得到证实和定量，M2Pep的修饰增强了M2-TAM的靶向性。同时，细胞摄取具有时间依赖性。M2-TAM和肿瘤细胞之间的内化具有明显差异，证明了 M2Pep 修饰的外泌体对 M2 巨噬细胞的卓越靶向效率超越了癌细胞的摄取。同时作者还发现工程化的外泌体亦可被作为抗原呈递细胞 (APC) 的DCs内化，有利于触发体内免疫反应。

体外TAMs重极化诱导抗肿瘤活性

通过 CCK-8 细胞杀伤实验发现构建的三种工程化外泌体均未表现出对巨噬细胞的细胞毒性，表明其具有优异的生物相容性。在之后的transwell实验中，将经工程化外泌体处理的 Raw 264.7细胞接种到 transwell 系统的上室，将 4T1 细胞在下室共培养。为了检验M2-TAM重编程为M1-TAM的效果，通过RT-qPCR实验来分析M2-TAM重编程为M1-TAM之后，Raw 264.7细胞中M1和M2标志基因的表达水平。结果显示M2Pep-Exo、pIC、Exo(pIC)和M2Pep-Exo(pIC)四组全部增加了M1标志物（IL-6、iNOS、TNF-α和IFN-γ）的表达，同时pIC、Exo(pIC)和M2Pep-Exo(pIC)降低了M2标记物（CD206和IL-4）表达。特别是缀合了 M2Pep以及pIC 封装的 M2Pep-Exo(pIC) 表现出最明显的 M1基因表达增强和 M2基因表达减少。其出色的重编程性能可能是由M2Pep介导的被M2-TAM增强内化引起的。

此外，免疫荧光实验检验的复极效应结果表明，用M2Pep-Exo(pIC)处理组相比M2Pep-Exo、pIC和Exo(pIC) 各组表现出最高的iNOS（M1 标记物）表达水平和最低的CD206（M2标记物）表达水平。检测炎症细胞因子含量的ELISA实验表明， M2Pep-Exo(pIC)显着上调促炎症细胞因子IL-6、TNF-α和IFN-γ的释放，并下调IL-10 的分泌水平，说明其具有最强的TAM 重极化活性。这些结果共同证明M2Pep靶向赋予外泌体有效地将poly(I:C)递送至M2-TAM中并将其重新编程为M1型TAM的能力。

人们普遍认为，重极化的M1-TAM分泌的经典促炎症细胞因子可以诱导免疫激活和抗肿瘤活性。为此，作者使用CCK-8检测transwell 系统下室中4T1细胞的细胞活力。正如预期的那样，M2Pep-Exo(pIC)的处理对4T1 细胞表现出显着的增殖抑制作用，说明其诱导的TAM重新编程可以诱导针对肿瘤细胞的细胞毒性。同时作者从4T1细胞中提取了总蛋白并通过Western Blot实验发现了M2Pep-Exo(pIC) 相比其他各组大大增强了促凋亡蛋白 (Caspase 3 和 Bax) 的表达，并降低了抗凋亡蛋白 (Bcl-XL) 的表达水平。这些发现都强烈表明 M2Pep-Exo(pIC)可以有效地恢复抗炎症性M2-TAMs转变为促炎症性M1型，导致体外肿瘤细胞增殖抑制和凋亡。

鹿茸是世界各地广泛使用的传统中药，据报道鹿茸提取物可以减少小鼠模型中的肿瘤形成，ASCs上清能够明显抑制肿瘤细胞的增殖并促进肿瘤细胞的凋亡。作者在此研究中也发现（CCK-8实验） Exo单独即可引起4T1 细胞活力的下降；poly(I:C) 的封装和M2Pep的修饰不会干扰这种抑制作用，而单独的 PIC 并没有表现出细胞活力的明显下降。因此，工程化的外泌体不仅具有直接的抗肿瘤活性，而且还能够重新诱导TAM间接有效地杀死肿瘤细胞。

M2Pep-Exo(pIC) 体外激活 DCs

Poly(I:C)作为TLR3激动剂，能有效促进DCs的成熟和分化。因此，将poly(I:C)封装在M2Pep-Exo(pIC)中有望增强APC的功能，从而达到有效的肿瘤免疫治疗效果。由于成熟的DC通常伴随着共刺激分子如CD80和CD86表达的增加，作者通过流式细胞术测量了不同外泌体处理后CD80+ CD86+双阳性DCs细胞的比例，证实了以上推论（在用 M2Pep-Exo(pIC) 治疗后，双阳细胞的百分比从 3.79 % 急剧增加至 40.7 %）。此外，DC 的成熟通常会导致促炎症细胞因子的释放。作者通过ELISA试剂盒和流式细胞术都检测到了Exo(pIC)和M2Pep-Exo(pIC) 处理的DCs培养上清中促炎症细胞因子TNF-α和IL-6的分泌增强。总而言之，这些结果表明，该具有poly(I:C)负载的工程化外泌体能够有效刺激DCs成熟并有效激活体外免疫反应。

体内M2Pep-Exo(pIC) 的抗肿瘤作用

通过尾静脉将DiI荧光标记的Exo和M2Pep-Exo 注射到小鼠体内24小时后，收集主要器官和肿瘤并冷冻切片，然后在荧光显微镜下观察。肝脏和肾脏表现出强烈的荧光信号，表明肝脏和肾脏是Exo和M2Pep-Exo的主要靶器官。然而，与Exo相比，M2Pep-Exo在肿瘤部位的分布显着增加，在肿瘤内的优先积累有利于免疫反应的改善和抗肿瘤作用。

在小鼠体内荷瘤模型实验中，对照组肿瘤生长迅速，而M2Pep-Exo和pIC 组对肿瘤生长有轻微抑制作用（poly(I:C)体内代谢较块，疗效可能收到限制）；Exo(pIC)组因为其优越的递送效率和ASC 外泌体的协同抗肿瘤作用的肿瘤发展明显延迟；而M2Pep-Exo(pIC)组的抗肿瘤作用最强。小鼠体重在不同的处理组中表现出相似的增长趋势，这意味着工程外泌体的系统毒性较低。另外，对肿瘤切片进行TUNEL和Ki67（反映肿瘤细胞增殖水平的肿瘤恶性增殖标志物）免疫荧光染色显示M2Pep-Exo(pIC)组达到最高水平的细胞凋亡和高度增殖的肿瘤细胞显着减少，进一步验证了其优异的体内和体外抗肿瘤活性。

M2Pep-Exo(pIC) 体内激活免疫反应的评价

与体外结果一致，荷瘤小鼠的体内实验也发现工程化的外泌体具有更强的促进DCs成熟和TAM重编程的能力，从而引发针对体内肿瘤的强大免疫反应。使用流式细胞术分析 DC 成熟标记物 (CD11c+CD80+和CD11c+CD86+），M2Pep-Exo(pIC) 表现出成熟 DCs的最高百分比显着优于其他各组；同时， M2Pep-Exo(pIC)在体内也能够诱导 TAM 的重极化，从而重建 TME；此外，RT-qPCR实验同样证实M2Pep-Exo(pIC) 治疗大大提高了 M1-TAMs 标记 CD86 的 mRNA 水平，并降低了M2-TAMs 标记 CD206 的 mRNA 表达。这些数据表明，由于 M2Pep 缀合和 pIC 封装，M2Pep-Exo(pIC) 在肿瘤部位具有最强的促进 TAM 分化为具有促炎症能力的 M1 型TAM的能力。

M2-TAM 向 M1-TAM 的逆转通常伴随着其他免疫细胞，特别是细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTLs) 的刺激。经M2Pep-Exo(pIC) 治疗后的小鼠CD3+CD8+的CTLs细胞数量，相比Exo(pIC)治疗组，大大增加（流式数据）。表明M2Pep-Exo(pIC) 有效地改善了CTL在肿瘤中的浸润。

同时，在M2Pep-Exo(pIC) 治疗组中 TNF-α、IL-12、IFN-γ 和IL-1β 均高表达 (RT-qPCR)。此外,给药后的小鼠血清中 TNF-α、IL-6 和 IFN-γ 的释放量显著增加 (ELISA)，显示出细胞因子释放的放大作用。先天性 (TNF-α、IL-6) 和适应性 (IFN-γ) 细胞因子的上调表明 M2Pep-Exo(pIC) 可以增强机体免疫反应和激发体内强大的抗肿瘤免疫力。

为了进一步评估不同策略对抗肿瘤的效果，肿瘤组织的免疫荧光染色同样证明了M2Pep-Exo(pIC) 能够成功地缓解免疫抑制TME（M1-TAM的重极化）并在体内产生强烈的抗肿瘤活性（CTL在肿瘤部位的增加）。

M2Pep-Exo(pIC) 联合PD-L1抗体的体内转移肿瘤抑制作用

理想的肿瘤治疗不仅应破坏原发肿瘤，而且还要有效抑制或消除转移部位残留的肿瘤细胞。PD-L1检查点抑制剂具有通过抑制CTLs耗竭来增强抗肿瘤免疫反应的能力。将 PD-L1 阻断与其他治疗药物相结合被认为是消除转移部位残留肿瘤细胞的一种有前景的方法。53.54 。因此，受以上工程化外泌体重组免疫抑制TME结果的鼓舞，作者进一步评估了M2Pep-Exo(pIC) 与抗PD-L1抗体治疗相结合的对于远距离转移肿瘤的治疗潜力。在开发的“双侧”4T1 荷瘤小鼠模型（在原发性肿瘤植入7天后将人工转移肿瘤植入右侧）实验中，对照组相比，单独的PD-L1抗体治疗稍微推迟了原发肿瘤的生长，并且在转移肿瘤中显示出有限的疗效，而M2Pep-Exo(pIC) 治疗明显延迟了原发性和远端肿瘤的进程。值得注意的是，M2Pep-Exo(pIC)与PD-L1抗体的组合不仅极大地抑制了原发肿瘤，而且还显著地抑制了远端肿瘤的生长，在两个位置均获得了最大的肿瘤重量和体积的下降，在所有实验组中诱导了最明显的肿瘤细胞凋亡。同时，M2Pep-Exo(pIC)结合PD-L1抗体的治疗不仅可以提高原发性肿瘤中CTLs细胞的比例，而且在远端肿瘤中与单一治疗组相比均表现出显著的CTLs浸润增加，并表现出最大浓度的促炎症细胞因子（TNF-α、IL-6 和 IFN-γ）水平。因此，联合治疗可重建免疫抑制TME并增强CTLs的浸润，有效地激活抗肿瘤免疫反应，从而实现对原发性和转移性肿瘤的卓越协同抑制。

图2. 与免疫检查点抑制剂相结合激活免疫反应并抑制肿瘤生长的M2Pep-Exo(pIC) 合成 (A) 和机制 (B) 示意图

结论

作者成功构建了一种高效且生物相容的基于外泌体的工程纳米药物递送系统——用 M2 巨噬细胞靶向肽 M2Pep 进行修饰，并用 TLR3 激动剂 poly(I:C)封装的鹿茸干细胞来源外泌体最有效地靶向 M2-TAM，从而增强肿瘤部位的外泌体和 poly(I:C) 富集。M2Pep-Exo(pIC) 可以通过重极化 M2-TAM 来重建免疫抑制性 TME转变为 M1-TAM并诱导 DC 成熟，从而促进促炎症细胞因子的释放和 CTLs 的浸润，实现有效的癌症治疗。此外，与PD-L1免疫检查点阻断联合治疗时，M2Pep-Exo(pIC)不仅可以抑制原发肿瘤，还可以抑制转移肿瘤（图2）。该工作为治疗转移性恶性肿瘤提供了一种有前景的联合用药方案。

本研究中使用到的NanoCoulter——纳米库尔特单颗粒分析仪，采用新一代纳米电阻脉冲感应 (RPS) 原理，粒径分辨率（灵敏度）可达到1 nm。依次检测样本中每一个颗粒的原始粒径，实现真正意义上的单颗粒检测，数据精度媲美电镜，专门适用于如外泌体等的多分散性生物样本；可以实现纳米颗粒浓度的精确检测（R²> 0.999）；并且是目前唯一可以兼具单颗粒zeta电位和粒径同时分析的检测方法，直接获得粒径/电位二维散点图，一站式完成外泌体的全面颗粒表征与分析，助力基于细胞外囊泡等的科学研究与药物开发。

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