权威推荐 | NanoCoulter 纳米库尔特粒度仪全面满足MISEV2023最新要求！

• 没有任何一种测量方法能够满足所有 EV 表征的要求，因此建议使用正交方法（即没有相同测量限制的方法）彼此验证。尤其是光学方法与非光学方法分别检测EV的粒径和浓度（P21, 22, 23, 27, 32, 36）。
• 需要公布检测方法的 LOD（检测限），从而允许其他人验证结果，而不管灵敏度限制如何。通过使用正交方法可以提高EV 浓度测量的可信度，每种方法都具有确定的 LOD，例如检测光散射强度、荧光强度和物理大小（P22, 23, 24, 27, 32, 36）。
• 需要公布样本连续稀释的浓度结果，以证明所得浓度数据处于系统测量的线性区间内（P22, 32）。
• EVs是复杂的多分散的生物流体样本。研究者应共享检测到的 EV 直径分布，而不仅仅是平均大小、集中大小或中位值大小等综合指标，这些指标很容易由于 LOD 和不对称大小分布而倾斜（P23, 27, 31, 32, 36, 37）。

• 报告RPS检测之前的样本前处理步骤。
• 建议纳入空白缓冲液的对照，以及相同浓度的样品经去污剂裂解后的结果。
• 公布所有设备及软件细节。
• 公布RPS的直径分布，而不是单个粒径统计数据（平均值、集中值、中位值）。

正交实验方法是研究多因素多水平试验的一种常用设计方法，也就是当确定关键质量属性(CQA)的参数时，推荐采用两种或两种以上不同原理的方法检测同一指标。由于许多EV表征方法不是特定适用于EV的，或者无法检测所有的EV，而检测同一表征参数的正交方法（不止一种原理的方法）不太可能具有相同的偏差，因此使用多种不同原理的表征方法对EV 样本进行分析，互为正交，互相验证，可以更加确保发表的EV数据的可靠性和可重复性。

MISEV2023首次将RPS技术作为与基于流式的方法（包括基于微珠的流式和单EV流式）和基于显微镜的方法（包括原子力显微镜、电镜、DLS、NTA、超分辨显微镜等）并列推荐的常用EV颗粒表征方法。RPS方法作为电学原理的技术，也是常用EV粒径和浓度表征中唯一一个“非光学”原理的检测手段，可以很好地同其他光学原理方法（如电镜、NTA、原子力显微镜、纳米流式等）形成正交，彼此验证，从而保障和体现数据地严谨性。NanoCoulter作为RPS设备中的佼佼者，已在多家外泌体企事业单位、药品监管机构和国家计量单位中进行过全面验证，并得到公认的可信赖数据（粒径、浓度检测精确度CV%< 5%，准确度回收率< ±3%，n≧ 10）。

并且，每一份样本检测报告均出具LOD范围内的粒径分布直方图，同时也展示样本的平均粒径、集中粒径、中位粒径以及宽度系数 (Span) 等综合统计指标。

MISEV2023建议在发表或公布某个样本的浓度数据时，同时附上浓度定量所采用的检测方法，以及该方法在包含所示样本浓度的某个浓度区间中，连续稀释样本的浓度线性关系数据。这一方面，NanoCouler凭借先进的绝对定量原理，以及精确的浓度检测稳定性，一经推出市场便获得广大用户的青睐，可谓遥遥领先。NanoCouler的浓度LOD（检测限）为5x10⁷- 2x10¹¹ particles/mL，同时即使是浓度的LOQ（定量限，R²> 0.999）都可以在跨三个数量级（10⁸- 10¹⁰ particles/mL，如下图）范围中保持良好的线性相关。

粒径检测的高灵敏度（单颗粒粒径）和高分辨率（< 1 nm） 是RPS技术的明显优势。而与此同时由于纳米孔芯片的设置，存在较大颗粒的复杂样本（如未经纯化的细胞培养上清）也就很容易发生堵塞，因此MISEV建议使用离心或过滤等分析前步骤来去除较大颗粒，同时延长纳米孔寿命。同时应明确说明任何分析前处理程序，以便这些方法更合理地同正交方法进行比较。根据参考文献，推荐用户采用以下超离或超滤步骤：

【超速离心法 (UC)】

方法一：取100-150 mL新鲜或解冻的细胞悬液或尿液，使用超速离心机固定角度转子（k-factor 131，最大加速和最大减速），或4 mL血浆样本（k-factor 131，最大加速和最大减速）在4°C下以120,000 g离心2 h。在第一次离心后，用PBS重悬EV颗粒，随后在4°C继续以120,000 g在同一管中进行第二次离心2 h。除去上清液后，将EV样本收集重悬于100 µL PBS中 ^[2]。（也建议预先将细胞培养基样本以2000  g离心两次，每次10 min，用以去除细胞或较大的细胞碎片，之后用0.45 µm的滤膜过滤后再进行超离提纯，效果更佳）

方法二：分离细胞系EV时，当贴壁细胞融合度达70%以上时，收集细胞培养基。2000  g离心10 min，去除细胞和较大碎片。将样本10,000 g离心1 h，之后经0.45 µm的滤膜过滤，再100,000 g离心1.5 h后，将EV样本收集重悬于100 µL PBS中 ^[3]。

【体积排阻色谱 (SEC) 与超滤】

MISEV2023在NTA和RPS技术要求中均提出建议“将空白缓冲液的对照纳入检测流程，来识别检测背景”。而NanoCoulter恰恰在设计之初就在每个单次样本的检测前，在程序的标准操作流程中设置了空白缓冲液（或稀释液）的对照（如下图红框），即每一次检测待测样本前，程序上必须先以空白缓冲液上样检测，并确认检测电信号基线以及排除潜在的残余杂质风险。并且，瑞芯智造团队在设备标配缓冲液中加入微量表面活性剂（不影响囊泡），从而帮助颗粒样本的分散。空白对照的设置，帮助用户严谨实验，确定空白背景是否存在干扰的同时，亦增加了芯片耗材的利用频次，极大程度地可重复使用，降低检测成本。

经Triton X-100处理，EV颗粒数目明显下降，该样品纯度= (1-破膜后/破膜前) *100% = 87.2%。

NanoCoulter系列纳米库尔特单颗粒分析设备问世之后，也在不断汲取客户建议反馈的同时，进行着持续地软硬件革新与完善。目前软件已升级至v3.2版本（产品说明详细展示了设备及软件细节），且将会继续保持以季度为单位的软件更新频率，并承诺向广大用户提供免费升级与技术支持服务，助力细胞外囊泡等纳米颗粒领域的研究不断发展。

1、Welsh JA, Goberdhan DCI, O'Driscoll L, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 2024;13(2)

2、Dong L, Zieren RC, Horie K, et al. Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium. J Extracell Vesicles. 2020;10(2)