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各种型号的超微量分光光度计基本结构都相同,由如下五种部分组成:1)光源(钨灯、卤钨灯,氢弧灯,氘灯、氙灯或激光光源);2)单色器(滤光片、棱镜、光栅、全息栅);3)样品吸收池;4)检测系统(光电池、光电管、光电倍增管);5)信号指示系统(检流计、微安表、数字电压表、示波器、微处理机显像管)。
各位好!有个问题想请教大家:具体情况如下:配制60mg/L 重铬酸钾溶液,用岛津UV2450(普通紫外分光光度计)测量235nm、257nm、313nm、350nm出的吸光值,然后计算吸光系数,结果符合药典要求。现在有一台超微量紫外分光光度计,加样量2ul左右,测试的吸光度比岛津偏低,计算出来的吸光系数自然就比药典要求低!现在有问题:1、超微量紫外分光光度计是否能够用重铬酸钾溶液衡量吸光准确度?2、是所有的紫外分光光度计(无论普通还是微量),只要在量程范围内,测试同一物质吸光度是否都要一致?个人理解是需要保持一致!3、超微量紫外分光光度计通常用于核酸和蛋白浓度测量,如果重铬酸钾吸光系数不准确,是否影响核酸和蛋白的测量结果?4、如何评价超微量紫外分光光度计的性能?5、测量蛋白溶液的浓度CV很好,但是测量重铬酸钾的吸光值总在变化(不同时间测试变化较大,偏差可大于5%),又是什么原因?虽然对于上面的问题,我认为只要是紫外分光光度计,原理一致,那么在量程内就应该保证结果一致!现在想听听大家的意见和看法!
在紫外—可见分光光度计的使用中,标准比色池的样品容量是3毫升左右;当样品量很少且液面低于光轴时,单色器发出的用于测量光束(即光斑)照射不到样品溶液的侧面上,等于无法测量,尤其是萃取量很少的生化样品的分析。这点恐怕许多人都深有体会。见图-1所示:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/06/201206022301_370041_1602290_3.jpg图-1 用标准比色池测微量样品的示意要想解决这个矛盾,一般的情况下,是将平时经常使用的标准比色池改为微量比色池,如图-2所示:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/06/201206022302_370042_1602290_3.jpg图-2 改用微量比色池测试样品但是如果操作者手头一时没有微量比色池又怎么办呢?其实我们稍微动动手,问题则会迎刃而解。方法是:将一条宽度约为10毫米的白纸条插入到样品池的支架中;然后将波长调到530nm,此时会在白纸条上看到一个长方形绿色的光斑(注意:仪器周边环境要保持暗一些,否则不易看到绿光斑),并用笔在光斑处坐上记号,如图-3所示:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/06/201206022303_370043_1602290_3.jpg图-3 用笔在白纸条上的光斑处做上记号找一块黑色的海绵(泡沫塑料也可),根据光斑(即光轴坐标)与池架底部的垂直高度和池架内部的长宽,将海绵裁剪成为一个合适尺寸的块状物。需要注意的是:海绵的高度要略小于光斑高度,具体小多少,要依据样品量而定;这样做的目的,是给比色池的安放留有余地。见图-4所示:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/06/201206022305_370044_1602290_3.jpg图-4 裁剪海绵体将裁剪好的海绵安放到池架内,如图-5所示:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/06/201206031109_370064_1602290_3.jpg图-5 放置海绵体最后将标准比色池放置在池架内的海绵上,注入少量的溶液,以液面超过光轴坐标的垂直高度即可;见图-6所示:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/06/201206031113_370065_1602290_3.jpg图-6 安放标准比色池这种举措不但节省了溶液量和购置价格相对昂贵的微量池的费用,还有一个微量比色池不能比拟的优点,那就是:无需顾忌光斑与微量比色池透光槽的对位不良的问题。当然,这种举措也有它的局限性,就是样品量不能过少。为此、要根据所测试样品的平均量来剪裁海绵块的高度;海绵块的高度过高了,比色池同步也上抬了,光斑容易照到比色池的底部,造成测试误差;海绵块高度过低了,比色池随之下降,池子里注入的液体样品液随之增加了,这样则无谓地浪费了样品,没有体现出微量分析的初衷;因此做好二者高度的兼顾稍显麻烦些,需要有一定的耐心。谨记!