无菌封管机

简介 细胞培养的成功很大程度上取决于保护细胞免受细菌、真菌和病毒等微生物的污染。非无菌物品、培养基和试剂、带有微生物的空气颗粒、不干净的培养箱和污染的工作台面均是导致微生物污染的来源。 无菌技术的作用是在环境微生物与无菌的细胞培养物之间形成一道屏障，它通过一套操作流程来降低培养物被上述污染源污染的可能。无菌技术的组成要素包括:无菌工作区域、良好的个人卫生、无菌试剂和培养基以及无菌操作。 无菌工作区域 最为简单、经济的减少空气颗粒和气体挥发(例如:灰尘、芽孢、皮屑、喷嚏) 污染的方法就是采用细胞培养通风橱。 细胞培养通风橱应正确设置，放置于专门用于细胞培养的区域，同时要避免来自门、窗及其他设备的气流，不能有直接的来往通道。 工作台面应保持整洁，只放置特定实验所需的物品 不能用作储存区域。 使用前后均应彻底消毒工作台面，周围区域和设备应定期清洁。 常规清洁时，工作前和工作过程中，特别是发生泼溅后，应使用70%乙醇擦拭工作台面。 使用完毕后，可用紫外灯对细胞培养通风橱内空气和暴露在外的工作台面进行消毒。 在细胞培养通风橱内不需要也不建议使用煤气灯火焰。 细胞培养通风橱应始终保持运转，长时间不使用时方可关闭。 良好的个人卫生 操作细胞培养物前后应洗手。穿戴个人防护设备不仅可保护您免受危险品污染，还可降低皮屑以及衣服上污物和灰尘污染培养物的可能。 无菌试剂和培养基 商品化试剂和培养基经过严格的质量控制以确保其无菌性，但是在操作过程中这些产品可能被污染。应遵循以下无菌操作原则以免污染。必须采用适当的灭菌方法(例如:高压蒸汽、无菌过滤)对实验室中配制的所有试剂、培养基和溶液进行灭菌。 无菌操作 必须用 70% 乙醇擦拭双手和工作区域。 在将容器、培养瓶、培养板和培养皿放入细胞培养通风橱之前，必须用 70% 乙醇擦拭其外部。 不要从试剂瓶或培养瓶中直接倾倒培养基和试剂。 使用无菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液体 每支吸管只能使用一次，以免交叉污染。使用时方可打开无菌吸管的包装。吸管应始终位于工作区域内。 试剂瓶和培养瓶用后必须盖上，用胶带将多孔板密封起来或者将其放入重复密封袋中，以免微生物和空气污染物进入，污染培养物。 无菌培养瓶、试剂瓶、培养皿等物品使用时方可揭开盖子，不得将其开放暴露于环境中。操作完成后尽快盖上盖子。 取下盖子时应将盖子开口朝下放在工作台面上。 必须使用无菌玻璃器皿和其他设备。 进行无菌操作时不要说话、唱歌或者吹口哨。 尽快完成实验，以尽量避免污染。 无菌技术核对内容 工作区域 细胞培养通风橱设置是否正确? 细胞培养通风橱所在区域有无气流和直接出入通道? 工作台面是否整洁?是否仅仅放置了实验所需的物品? 开始工作前用 70%乙醇擦拭工作台面了吗? 是否定期对培养箱、冰箱、冰柜及其他实验室设备进行清洁和消毒? 个人卫生 您洗手了吗? 您穿戴个人防护设备了吗? 如果您留了长发，您把头发扎在后面了吗? 您是用移液器操作液体吗? 试剂和培养基 您采用适当的方法对实验室中配制的所有试剂、培养基和溶液进行灭菌了吗? 在将容器、培养瓶、培养板和培养皿放入工作台面之前，您用 70%乙醇擦拭其外部了吗? 试剂瓶、培养瓶及其他容器不使用时盖紧了吗? 是否已将所有培养板均放入无菌重复密封袋中? 是否有试剂外观浑浊?是否被污染了?试剂中有漂浮颗粒吗?有难闻气味吗?有颜色异常吗?如果出现上述情况，是否已对其进行去污并丢弃? 操作 您操作时是否缓慢、谨慎、注意无菌技术了? 在将移液器、试剂瓶和培养瓶放入细胞培养通风橱之前，用 70% 乙醇擦拭其表面了吗? 是否将盖子口朝下放置在工作区域? 您是使用无菌玻璃吸管或者一次性无菌塑料吸管操作液体吗? 无菌吸管是否仅仅使用一次以免交叉污染? 您是否注意到避免使吸管尖端触碰到任何非灭菌物品包括瓶口螺纹的外缘? 发生液体泼溅时是否立即吸干并用 70% 乙醇擦拭该区域?

1、洁净室（无菌室）要符合规范要求：无菌室应采光 良好、避免潮湿、远离厕所及污染区。面积一般不超过10m2，不小于5m2；高度不超过2.4m。由1—2个缓冲间、操作间组成（操作间和缓冲间的门不应直对），操作间和缓冲间之间应具备灭菌功能的样品传递箱。在缓冲间内应有洗手盆、毛巾、无菌衣裤放置架及挂钩、拖鞋等，不应放置培养箱和其他杂物；无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。操作间内不应安装下水道。 无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，操作区洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温度控制18—26℃，相对湿度45%—65%。缓冲间及操作室内均应设置能达到空气消毒效果的紫外灯或其他适宜的消毒装置，空气洁净级别不同的相邻房间之间的静压差应大于5Pa，洁净室（区）与室外大气的静压差大于10Pa。无菌室内的照明灯应嵌装在天花板 内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300lx。缓冲间和操作间所设置的紫外线杀菌灯（2—2.5w/m3），应定期检查辐射强度，要求在操作面上达40uw/m2。不符合要求的紫外杀菌灯应及时更换。 2、建立使用登记制度在登记册中可设置以下项目内容：如使用日期、时间、使用人、设备运行状况、温度、湿度、洁净度状态（沉降菌数、浮游菌数、尘埃粒子数 ）、报修原因、报修结果、清洁工作（台面、地面、墙面、天花板、传递窗、门把手）、消毒液名称等。3、建立使用标准操作规范（SOP）并严格管理:SOP内容至少要有以下几点： （1）规定净化系统使运转时间要求每次实验前应开启净化系统使运转至少1h以上，同时开启净化台和紫外灯。 （2）物品进入洁净室（无菌室）基本要求：凡进入洁净室（无菌室）的物 品必须先在第一缓冲间内对外部表面用消毒剂消毒灭菌，再经物流缓冲间、传递窗1h以上，及无菌空气吹干后送入无菌室。注意带纤维、易发尘物品不得带进净化实验室。无菌室内固定物品不得任意搬出。 （3）人员进入洁净室（无菌室）要求：实验人员进入洁净室（无菌室）不得化妆、带手表、戒指等首饰；不得吃东西、嚼口香糖。应清洁手后进入第一缓冲间更衣，同时换上消毒隔离拖鞋，脱去外衣，用消毒液消毒双手后戴上无菌手套，换上无菌连衣帽（不得让头发、衣等暴露在外面），戴上无菌口罩。然后，换或是再戴上第二副无菌手套，在进入第二缓冲间时换第二双消毒隔离拖鞋。再经风淋室30s风淋后进入无菌室。 （4）温湿度观察要求：观察温度计、湿度计上显示的温湿度是否在规定的范围内，并作为实验原始数据记录在案。如发现问题应及时寻找原因，及时报修和及时报告实验室主管，并将报修原因和结果记录归档。 （5）沉降菌落计数与浮游菌测定要求：在每次实验同时，对操作室和层流台做微生物沉降菌落计数，将结果记录在使用登记本上，并作为实验环境原始数据记录在实验报告上。每周1次，或在无菌检查等必要时，在每次实验同时对操作室和净化台进行浮游菌测定，将结果记录在使用登记本上，并作为实验环境原始数据记录在实验报告上。 （6）消毒要求：无菌室每周和每次操作前用0.1%新洁尔灭或2%甲酚液或其他适宜消毒液（常用消毒剂的品种有：5—20倍稀释的碘伏水溶液、0.1%新洁尔灭溶液、1：50的84消毒液、75%乙醇溶液、3%碘酒溶液、5%石炭酸（来苏儿）消毒溶液、2%戊二醛水溶液、尼泊金乙醇消毒液（处方：对羟基苯甲酸甲酯21.5g；对羟基苯甲酸丙酯8.6g，75%乙醇10ml）等，所用的消毒剂品种与使用要进行有效性验证方可使用，并定期更换消毒剂的品种）擦拭操作台及可能污染的死角，方法是用无菌纱布浸渍消毒溶液清洁超净台的整个内表面、顶面、及无菌室、人流、物流、缓冲间的地板、传递窗、门把手。清洁消毒程序应从内向外，从高洁净区到低洁净区。逐步向外退出洁净区域。然后开启无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1—2h，以杀灭存留微生物。在每次操作完毕，同样用上述消毒溶液擦拭工作台面，除去室内湿气，用紫外灯杀菌30min。 （7）其他要求：如遇停电，应立即停止实验，离开无菌室。关闭所有电闸。重新进入无菌室前至少开启机房运转1h以上。4、洁净度检查的要求与方法：无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数，以此来判断无菌室是否达到规定的洁净度，常有沉降菌和浮游菌测定方法。 （1）沉降菌检测方法及标准：以无菌方式将3个营养琼脂平板带入无菌操作室，在操作区台面左、中、右各放1个；打开平板盖，在空气 中暴露30min后将平板盖好，置32.5℃士2.5℃培养48h，取出检查，3个平板上生长的菌落数平均小于1个。 （2）浮游菌检测方法及标准：用专门的采样器，宜采用撞击法机制的采样器，一般采用狭缝式或离心式采样器，并配有流量计和定时器，严格按仪器说明书的要求操作并定时校检，采样器和培养皿进入被测房间前先用消毒房间的消毒剂灭菌，使用的培养基为营养琼脂培养基或药典认可的其他培养基。使用时，先开动真空泵抽气，时间不少于5min，调节流量、转盘、转速 。关闭真空泵，放入培养皿，盖上采样器盖子后调节缝隙高度。置采样口采样点后，依次开启采样器、真空泵，转动定时器，根据采样量设定采样时间。全部采样结束后，将培养皿置32.5℃士2.5培养48h，取出检查，浮游菌落数平均不得超过5个/m3。 每批培养基应选定3只培养皿做对照培养。 无菌操作台面或超净工作台还应定期检测其悬浮粒子，应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪）检测，并根据无菌状况必要时置换过滤器。5、定期进行洁净度再验证：定期（每季度、半年、1年）或当洁净室设施发生重大改变时，要按国家标准GB/T16292-16294-1996《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》进行洁净度再验证，以确保洁净度符合规定，保存验证原始记录，定期归档保存，并将验证结果记录在无菌室使用登记册上，作为实验环境原始依据及趋势分析资料。并定期对洁净室的环境检测数据进行趋势分析和评估，根据评估结果，了解洁净室设施环境质量的稳定状况及变化趋势，决定是否有必要修订相应的警戒和纠偏限度。6、定期更换新的紫外灯管、更换净化系统的初效、中效、高效头：定期（至少每年1次）更换新的紫外灯管，以确保紫外灯管灭菌持续有效。并同时在使用登记本上做好更换记录，定期归档保存。至少2年1次，或按洁净度验证实际情况，定期更换初效、中效、高效头。以确保净化系统的功能持续有效，并同时在使用登记本上做好更换记录，定期归档保存。7、使用过程中应尽可能减少人员的走动或活动：平时实验室内应尽可能减少人员的走动或活动，同向洁净室的门要关闭或安装自动闭门器使其保持关闭状态。8、洁净度不符合规定时立即停止使用：发现洁净度不符合规定时，应立即停止使用，寻找原因，彻底清洁、必须经洁净度再验证符合规定后，才再使用，并同时将情况记录在无菌室使用登记册上，定期归档保存。9、对进入的外来人员或维修人员进行指导和监督：非微生物室检验人员不得进入洁净室（无菌室），对必须进入的外来人员或维修人员要进行指导和监督。10、洁净室（无菌室）的日常管理：建立安全卫生值日制度，一旦发现通风系统、墙壁、天花板、地面、门窗及公用介质系统等设施有损坏现象，要及时报告并采取相应的修复措施，并保存记录及时归档。从洁净室（无菌室）环境中检测到的微生物应能鉴别至属或种，保留鉴别实验原始记录及菌种，作为无菌生产、无菌检查洁净室环境质量、消毒剂有效性评估及污染源调查的依据，并且也是为无菌检查阳性结果的调查提供第一手资料。

4.1培养基的准备选用硫乙醇酸盐流体培养基：硫乙醇酸盐流体培养基200g注射用水6600ml加注射用水搅拌混合均匀并慢慢加热溶解，然后煮沸1分钟，在121℃高压灭菌30分钟。4.2试验条件 4.2.1在进行培养基无菌灌装试验前，应对车间无菌作业的环境进行全面监测，包括空气悬浮粒子监测、表面微生物监测、空气浮游菌监测、层流罩下的沉降菌监测，以及人员的个人卫生（如工作服、手的微生物污染状况）监测。只有各项监测结果达标时，方可进行培养基灌封。4.2.2严格按照生产厂商的配制要求，在配料间用注射用水配制培养基。除菌过滤前，用一无菌瓶取50ml培养基溶液，用作除菌过滤前培养基溶液的微生物污染水平检测，除菌过滤作业完全模拟实际生产。4.2.3由受过培训的无菌生产操作人员模拟实际的灌装作业进行培养基灌封，其灌装容器及胶塞与产品生产时完全一致，每批灌装数量3300瓶以上，每瓶灌装量与实际产品相同。4.2.4西林瓶、胶塞、安瓿瓶和灌装用管道用具等按生产工艺要求进行灭菌。4.2.5人员按工艺要求穿灭菌的洁净工作服操作。