肿瘤标志

20世纪基因组学研究取得的巨大成就为蛋白质组学的发展奠定了基础。蛋白质组学是从整体水平上分析生命体、组织或细胞的蛋白质组成及其活动规律的科学，以基因表达产物为研究对象，延伸了基因组学研究深度，更深层次地揭示了生命活动规律。蛋白质组学的研究内容主要包括蛋白质表达存在方式(修饰形式)的鉴定、结构与功能分析、蛋白质定位、蛋白质差异表达以及蛋白质间相互作用分析等[1]。目前蛋白质组学研究技术主要包括：二维电泳技术、蛋白质芯片技术、质谱技术等[2]。其中，二维电泳技术是早期蛋白质组学的重要技术之一，但是由于实验步骤多，耗时长，重复性差等特点，已经逐步被新型技术所取代。蛋白质芯片技术是将多种蛋白质纯品点于芯片表面，形成蛋白质矩阵进行免疫等标记反应，主要受限于很多蛋白质无法获得纯品而不能用于芯片制备。质谱技术由于灵敏度高、特异性强、分析范围宽等优点逐渐成为蛋白质组学的主要研究手段，可以对特定生命过程中的功能性蛋白质分子进行定性和定量检测，因此在基础科研和临床研究中得到了广泛的应用[3,4]。一、基于质谱的蛋白质组学技术1．基于质谱的蛋白质组学定性技术：蛋白质定性鉴定的基本原理在于：蛋白质组的基本序列已经通过基因组学信息获得，可以用来鉴定多肽的氨基酸序列，并且获得多肽与蛋白质的对应关系[1]，即质谱提供的多肽碎片数据可以与蛋白质数据库自动匹配来确定多肽序列与蛋白质归属。基本技术策略分为：(1)自上而下(Top–down)策略[5]，即完整蛋白质在质谱中进行分析，可以提供完整蛋白质的质量数，但是由于质谱仪受到质量分析范围的限制，此方法在常规实验室不易实现。(2)自下而上(Bottom–up)策略[6]，即蛋白质被蛋白酶水解成多肽，然后对多肽进行质谱分析和碎裂。基于这条策略的大致步骤为：蛋白质样品首先经过酶解降解为多肽，然后对多肽进行色谱–质谱分离与鉴定，最后通过搜索引擎(MASCOT：http：//www.matrixscience.com/server.html, SEQUEST：http：//fields.scripps.edu/sequest等)在公共蛋白质组学数据库(SWISS–PORT: http：//web.expasy.org/groups/swissprot, NCBI：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed等)中自动完成质谱数据的解析，确定多肽序列与蛋白质种类。该技术灵敏度高，特异性好，仪器自动化程度高，可以鉴定出生物样品中成千上万种蛋白质，被认为是大规模、高通量蛋白质定性检测的首选方法。2．基于质谱的蛋白质组学相对定量技术：对于大多数生命科学和医学研究来说，仅完成样品中蛋白质组的定性研究是远远不够的，还需要对蛋白质组进行定量分析。由于组学的研究对象是多个蛋白质，单次检测很难实现所有蛋白质的绝对定量，因此蛋白质组学定量多为相对定量检测。蛋白质组学定量的质谱技术包括谱图计数、质谱峰强度定量、同位素定量技术等。其中使用同位素作为内标定量的方法是目前质谱定量的最佳手段，即对整体蛋白质组进行同位素标记，并使用每一种天然蛋白质与同位素蛋白质的比值进行相对定量分析。主要分为细胞层面标记和蛋白质层面标记两种技术路线：(1)细胞层面标记的细胞培养氨基酸稳定同位素标记(stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)方法[7]：即在两种细胞样品中分别加入轻重同位素标记的培养基，经过传代培养后，两种细胞样品中的全部蛋白质中分别嵌合了轻重同位素，可以在质谱上根据同位素的不同质荷比直接判断样品来源并进行定量比对。(2)蛋白质层面标记：使用含有同位素的小分子与样品全部蛋白质直接标记，如同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)[8]、同位素编码亲和标记(isotope–coded affinity tag，iCAT) [9]、18O标记[10]等方法，此类方法使用带有稳定同位素的小分子与特定氨基酸侧链反应，使得多个样品可以分别连接含有不同同位素个数(多至8个)的小分子，从而产生一级数据相同但是二级数据不同的质谱谱图，通过二级谱图强度比对进行多个样品的定量分析。3．基于质谱的目标蛋白质绝对定量技术：质谱技术对目标蛋白质的绝对定量检测主要通过质谱多反应监控技术与同位素多肽内标技术联用来实现[11]。该方法首先选定目标蛋白质的一个或多个多肽，合成序列相同但含有稳定同位素的多肽作为内标，定量加入样品中，通过监测特定多肽及其同位素多肽的质谱峰强度进行比对和计算获得目标蛋白质的定量值。质谱多反应监控技术通过进行母离子筛选与子离子筛选等二次选择过程，筛选出目标蛋白质，而非目标蛋白质由于无法通过筛选达到检测器，极大降低了噪音干扰。因此，此方法针对性强，本底噪音低，是目前质谱技术中定量能力最好的一种，可以控制变异系数小于15%，检测限低至纳克每毫升，适合血液、组织等临床样品的定量检测[11]。二、质谱技术发现肿瘤蛋白质标志物质谱技术作为一项强有力的研究工具在科学研究中发挥着巨大的作用，特别在肿瘤相关研究中，目前已经获得美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准的肿瘤标志物包括多种蛋白质前列腺特异性抗原(prostate–specific antigen, PSA), 癌胚抗原(carcinoembryonic antigen CEA), 人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，Her–2), 人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG), 糖类抗原CA125等，均揭示了蛋白质与肿瘤发生发展密切相关。这些已有成果极大促进了质谱技术在肿瘤蛋白质标志物研究中的应用，并取得了标志性进展。例如：美国约翰霍普金斯大学的Chan课题组发现了新型卵巢癌蛋白质标志物，他们使用表面增强激光解析电离质谱技术(surface enhanced laser desorption and ionization time–of–flight mass spectrometry, SELDI–TOF MS)技术对503个妇女的血清进行了蛋白质组学的分析[12]，在随后的大量临床验证中最终确定CA125、β2微球蛋白，转铁蛋白，甲状腺运载蛋白和载脂蛋白A1的联合检测可以作为卵巢癌的新型临床诊断指标。2009年9月该试剂盒OVA1(商品名称：http：//ova–1.com)获得了美国FDA的认证，进入临床使用，被认为是国际肿瘤蛋白质标志物研究的重要标志性成果。同时，肿瘤仍然是国际上致死率最高的疾病之一，缺乏早期检测技术和有效治疗方案，临床中还存在着大量问题需要解决，新型标志物的研发迫在眉睫。由于肿瘤蛋白质标志物研究的难度大，风险高，因此近十年来仅有几例试剂盒获得了美国FDA批准，进入临床使用。大量标志物研究还停留在论文研究水平，其中临床问题、研究思路和技术方案的选择直接关系到研究的成功与否。1．临床问题选择：在肿瘤蛋白质标志物研究中，临床问题的选择是研究核心。在肿瘤研究中，需要解决的临床问题往往包括肿瘤早期检测、肿瘤分期检测、治疗方案与药物选择、疗效评估等多个方面。研究者需要根据不同肿瘤的临床情况，具体分析并凝练不同肿瘤的主要临床问题。例如，对于病程发展快、五年存活率低、没有有效手术或化疗手段的肿瘤，早期诊断是研究重点，如胰腺癌、卵巢癌、肺癌等；对于病程发展慢、手术效果明显的肿瘤，肿瘤的愈后与复发是需要关注的问题，如前列腺癌、肠癌等；还有一些肿瘤有特殊的检测需求，如乳腺癌虽然有临床有效的雌激素受体(estrogen receptor，ER)，孕激素受体(progesterone receptor，PR)，HER2等基因标志物，可以进行药物靶点治疗，但是三阴性乳腺癌的检测还缺乏有效的标志物与治疗方案。因此，在肿瘤蛋白质标志物研究实验开展之前，明确临床问题，并以此确定临床样品入组标准，是研究成功的核心基础。2．研究思路设计：不同于基础科学实验，临床实验需要在大量样本中进行实验结果的验证，因此肿瘤蛋白质标志物研究往往包括新型标志物发现和验证两部分。标志物发现实验是在疾病组和对照组之间进行蛋白质组学分析，鉴定样本中的未知蛋白质组并进行相对定量比较，分析数据选择出在两组样本中差异最大的一个或几个蛋白质作为新型标志物的候选物。随后，标志物验证实验在大量未知样本中进行蛋白质候选物的定量检测，使用发现实验中建立的区分标准进行判读，计算检测灵敏性(sensitivity)和特异性(specificity)。有效的蛋白质标志物研究往往需要发现与验证的两步设计思路来相互保证。3．技术方案选择：根据蛋白质标志物研究的两步设计思路，发现实验中使用基于质谱的蛋白质组学定性技术与相对定量技术对样本中的大量未知蛋白质进行分析，获得标志物候选物名单。验证实验中根据已有名单，进行目标蛋白质(非蛋白质组学)的精确定量检测。这几种质谱技术的配合使用，可以满足不同实验情况和目的，最终实现新型蛋白质标志物的成功研发。三、展望质谱技术是现阶段蛋白质组学研究的核心技术，具有灵敏度高、特异性强、分析通量大等优势，特别是其与同位素内标的联合使用，大大提高了质谱定量能力，因此在多种肿瘤标志物研究中取得了突破性进展并被广泛应用。目前，大量肿瘤蛋白质标志物候选物已经通过使用质谱技术被从血液、组织、体液中筛选出来，预计在完成大规模临床验证后可以作为新型标志物在临床使用，促进肿瘤检测水平的发展。同时值得注意的是，质谱技术还不具备进行蛋白质组的绝对定量能力。相对于免疫等传统蛋白质检测技术，仪器昂贵，操作复杂，自动化程度低，这些因素决定了质谱目前适用于蛋白质的临床研究，但不适用于蛋白质的临床检验，这是质谱技术面临的重要挑战之一。参考文献[1]何华勤. 简明蛋白质组学[M]. 北京:中国林业出版社, 2011:1,76,85-95,119,125-138.[2]RuediA, MatthiasM. 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[align=left][font='calibri'][size=16px]外泌体[/size][/font][font='calibri'][size=16px]作为标志物用于肿瘤的早期诊断[/size][/font][/align][font='times new roman'][size=16px]外泌体是一种磷脂双层膜包裹的生物纳米颗粒，直径为[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]30-200 nm[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。近年来，由于外泌体携带大量遗传物质，在介导细胞[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]-[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞间通信中发挥重要作用，已成为液体活检最理想的分析目标。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]肿瘤生物标志物的检测可以协助肿瘤的早期诊断和治疗。近年来，外泌体在肿瘤的发生发展过程中显示出重要的作用，逐渐成为重要的诊断生物标志物和治疗靶标。肿瘤来源的外泌体携带分子和基因载体，反映了肿瘤细胞的部分组成，广泛分布于血液和包括尿液在内的其他体液。这些外泌体可以作为一种微创的液体活组织检查，对肿瘤进行实时的非侵入性分析，帮助疾病的临床诊断。外泌体作为疾病诊断和预后的标志物，相比于传统的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]miRNA[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]分子具有明显的优势。肿瘤细胞衍生的外泌体携带的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]mRNA[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]miRNAs[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]和蛋白质等生物活性分子通常构成了肿瘤细胞的总蛋白质组或转录组的一部分，反映了亲本细胞的遗传信息。而且这些生物活性分子由于受到外泌体双层膜结构的保护使其在运输过程中不被降解。此外，这些外泌体在不同的储存情况下，包括在[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]4[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]℃下短期储存[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]96 h[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]或在[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]-80[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]℃下长期储存，都具有很强的活力。外泌体的这些特性使其成为癌症诊断、预后和治疗反应的重要监测指标。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]多项体外研究表明，通过应用蛋白质组学和转录组学的方法，使用外泌体及其内容物和表面蛋白可以更早地发现癌症，从而提高预后和生存率[/size][/font][font='times new roman'][size=16px][43][/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。结肠癌患者血浆标本中外泌体水平的提高与肿瘤细胞的整体存活率的下降有相当大的联系[/size][/font][font='times new roman'][size=16px][32][/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。另一项研究表明，外泌体上的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]CD24[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]EDIL3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]和纤维连接蛋白被认为是早期乳腺癌的标志物。此外，在非小细胞肺癌的外泌体中，研究人员发现表皮生长因子受体（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]EGFR[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]）、胎盘碱性磷酸酶（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]PLAP[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]）和富亮氨酸的α[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]-2-[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]糖蛋白[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]LRG1[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]）的过表达。最近的报告显示，使用无标记的液相色谱[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]-[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]串联质谱（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]）检测前列腺癌患者的尿液，研究人员发现存在于尿外泌体中的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]PCA3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]和[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]TMPRSS2:ERG[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]蛋白是潜在的生物标志物。这些发现表明从体液中分离得到的外泌体可能是肿瘤早期检测的重要非侵入性标记物。[/size][/font]

肿瘤是指体内细胞的异常增生，可以是良性的或恶性的。良性肿瘤（例如息肉）生长缓慢且通常局限在一个区域，不会侵犯周围组织或扩散到其他部位。恶性肿瘤（即癌症）具有侵袭性，可以快速生长并通过血液或淋巴系统扩散到其他身体部位，形成远处转移。癌症是一种严重威胁人类健康和生命的疾病，2020年全球有1 930万新增癌症病例和1 000万癌症死亡病例，且我国癌症发病率和死亡率均位居全球第一[1]。最常见的癌症类型是乳腺癌、肺癌、结直肠癌和前列腺癌。因此，寻找新的抗肿瘤药物，阐明抗肿瘤药物的分子机制，是解决当前临床肿瘤治疗难点的有效策略。中药具有多种有效成分，因其不良反应低、多靶点、多通路等优点，已成为抗肿瘤药物开发的重要来源和研究热点[2]。目前，常规的肿瘤症治疗方法为手术、放射治疗和化学治疗等，但这些方法往往伴随着较大的不良反应和毒性，而且对某些难治性或复发性肿瘤效果不佳[3]。因此，寻找有效、低毒的抗肿瘤药物是当前临床研究的重要方向。 苍术是一种常用的中药材，分为茅苍术Atractylodes lancea (Thunb.) DC.和北苍术A. chinensis (DC.) Koidz.，分别来源于菊科植物茅苍术或北苍术的干燥根茎。苍术具有燥湿健脾、祛风散寒的功效，在《神农本草经》中列为上品[4]。近年来，苍术在抗微生物、抗炎、抗肿瘤、免疫调节、调节消化系统、心血管系统和神经系统等方面的药理作用受到了广泛关注。苍术中含有挥发油、多糖、倍半萜类、聚乙炔类等[5]多种化学成分。其中一些成分已经被证实具有抑制或杀伤多种肿瘤细胞的能力，其作用机制涉及诱导凋亡、抑制增殖、迁移、侵袭和转移，以及调控免疫功能等方面[6]。然而，苍术中的抗肿瘤活性成分及其作用机制尚未完全明确，需要进一步深入地探索和验证。本文通过整理国内外研究文献，对苍术活性成分、苍术与其他药物联合抗肿瘤及其分子机制进行总结，探讨苍术在抗肿瘤方面的应用规律和思路，为苍术资源的开发利用以及抗肿瘤临床疗法的研究提供理论参考。 1 苍术主要化学成分 茅苍术与北苍术化学成分相似，药理作用也较为相似，目前已从苍术中分离出多种化学成分，主要含有包括萜类、聚乙烯炔类、有机酸类、糖苷类化合物等[7-8]。苍术主要抗肿瘤化学成分，见图1。茅苍术与北苍术中主要化学成分如表1所示。 图片 图片 2 苍术的抗肿瘤机制 苍术中含有苍术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、苍术酮、β-桉叶醇和苍术素等有效成分，这些成分不仅可以抗炎、抗氧化、抗菌、保肝、降血糖，还可以抗肿瘤[14-15]。近年来，苍术及其有效成分对肿瘤的抑制作用受到了广泛的关注。研究发现，苍术有效成分对多种肿瘤细胞都有抑制作用，可以通过多种途径和机制影响肿瘤细胞的生长、迁移、侵袭和血管生成，诱导肿瘤细胞的凋亡和自噬，调节肿瘤微环境和免疫系统。 2.1 抑制肿瘤细胞增殖 肿瘤是由于细胞增殖失控而形成的一种疾病[16]。细胞周期是细胞增殖的基本过程，由细胞周期蛋白（cyclin，CCN）和细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）复合物共同调控[17]。干预细胞周期是抑制肿瘤发展的有效策略之一[18]。Kotawong等[19]发现，苍术中的苍术素、苍术内酯I和β-桉叶醇等有效成分可以通过影响肿瘤细胞周期的不同阶段来抑制肿瘤细胞的增殖。这些成分可以通过抑制磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路来诱导肿瘤细胞在G1期停滞；Yu等[20]发现苍术内酯I通过上调周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，p21）和下调cyclinB1、CDK1和细胞分裂周期25C蛋白（cell division cyclin25，Cdc25c）等关键分子来抑制肿瘤细胞在G2/M期的进入，在动物模型中，苍术内酯I可以显著抑制膀胱癌的生长，且无明显不良反应。Zhang等[21]实验发现苍术内酯Ⅱ可以通过改变结直肠癌细胞内的蛋白表达从而抑制结直肠癌细胞的增殖和活性，并且还显著增强了结直肠癌细胞的化疗敏感性。Pongsakorn等[22]发现，苍术提取物可以通过抑制细胞外信号调节激酶信号级联（ERK-signaling cascade，ERK）信号通路来抑制胆管癌细胞的增殖。ERK信号通路是一种重要的细胞内信号转导机制，参与调节细胞生长、分化和凋亡等过程。苍术提取物可以下调ERK及其下游分子的表达，从而抑制胆管癌细胞的生长和增殖，不同类型的胆管癌细胞对苍术提取物的敏感度不同，其中人胆管HuCCT-1癌细胞最为敏感。 2.2 诱导肿瘤细胞凋亡 细胞凋亡是一种程序性细胞死亡形式，它通过限制细胞的增殖和分化来维持组织稳态或去除潜在的有害细胞[23]。目前已知的细胞凋亡途径主要有3种，即外源性途径（死亡受体介导）、内源性途径（线粒体介导）和内质网途径。其中，线粒体途径是最重要的一种，它涉及线粒体外膜透化（outer mitochondrial membrane，MOMP）、细胞色素C释放和半胱天冬酶（cysteine aspartic acid protease，Caspase）激活[24]。多项研究发现，苍术酮可以通过降低线粒体膜电位、提高活性氧水平、抑制B细胞淋巴瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）表达、促进BCL2-相关X蛋白（BCL2-associated X protein，Bax）裂解和Caspase-3表达[25]，以及下调PI3K/AKT/mTOR信号通路来诱导肿瘤细胞凋亡[26]。Narahara等[27]研究表明，β-桉叶醇和苍术内酯Ⅲ[27]可以通过增加Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Bax等凋亡相关蛋白的表达、下调Bcl-2表达、释放细胞色素C和降低线粒体膜电位来诱导胆管癌细胞凋亡。此外，Li等[28]使用β-桉叶醇处理的白血病HL60细胞，发现β-桉叶醇可以通过激活c-JunN端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路来诱导白血病HL60细胞凋亡。Li等[29]研究发现，苍术素可以通过降低Bcl-2表达、激活p53肿瘤蛋白（p53 tumor protein，p53）、Bax和Caspase-3、-8、-9等凋亡因子来诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡，并表现出浓度依赖的毒性效应。Li等[30]研究表明，苍术内酯I和苍术内酯Ⅱ[31]可以通过与对两面针激酶2（Janus kinase 2，JAK2）直接相互作用而负调节信号传导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）磷酸化，从而抑制其活化，进而导致糖酵解的抑制和结肠、直肠癌细胞凋亡的诱导。 2.3 抑制肿瘤细胞转移 肿瘤细胞转移是指肿瘤细胞通过血液循环从原发部位转移到其他部位的过程，这是癌症治疗的难点，也是癌症死亡的主要原因[32]。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是一种与癌症发生相关的细胞程序，它使癌细胞具有移动性、侵袭性和抗凋亡能力，从而促进转移。苍术的一些活性成分具有抑制肿瘤细胞转移的潜在作用，其机制可能涉及对EMT的调控[33]。Acharya等[34]研究发现，β-桉叶醇可以改变EMT相关标志物的表达，从而抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。同时它还可以影响PI3K、AKT、p38丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）信号通路，以及肺癌细胞中的活性氧水平，从而降低癌细胞的黏附和迁移能力[35]。麦静愔等[36]发现苍术酮可以通过抑制EMT过程等途径抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，此外，苍术酮还可以通过下调基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表达从而抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。MMP是一类能够降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的锌依赖性内肽酶，在癌症进展中的作用与它们参与ECM降解以及黏附和细胞骨架蛋白、生长因子、趋化因子的调节和加工有关[37]。且有动物实验表明，苍术酮可以明显抑制肝癌生长，没有明显的毒性。Zhong等[38]在观察了苍术多糖在U-2 OS人骨肉瘤细胞中对内皮细胞选择素（endothelial cell selectin，E-Selectin）和路易斯X三糖（Lewis-X Trisaccharide，LacCer Lex）的影响，发现苍术多糖可通过降低U-2 OS细胞上的E-Selectin抑制U-2 OS细胞对人脐静脉内皮细胞HUVECs的黏附、迁移和侵袭。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）在促进肿瘤转移中发挥重要作用，Zhang等[39]发现苍术内酯II可以有效抑制肿瘤细胞极化，从而抑制肺癌细胞在体内和体外的转移。铁死亡是一种新的细胞死亡模式，其特征是铁过载导致脂质过氧化而导致膜损伤，过度的铁死亡会影响肿瘤的转移，从而抑制肿瘤的进展[40]。He等[41]发现，苍术素可通过抑制谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）和铁蛋白轻链（ferritin light chain，FTL）的表达，以及上调酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）和转铁蛋白受体（transferrin receptor，TFR1）的表达来诱导肝癌HCCM细胞的铁死亡。 2.4 诱导肿瘤细胞自噬 细胞自噬是一种分解代谢通路，能清除不必要的或功能失调的细胞成分并回收代谢底物[42]。目前已知有3种主要的细胞死亡方式：细胞凋亡（Ⅰ型）、自噬性细胞死亡（Ⅱ型）和坏死（Ⅲ型）。自噬性细胞死亡是指自噬过程中产生的自噬体过多或过大，导致细胞质溶解和细胞死亡。自噬体是由双层膜包裹的囊泡，内含被降解的细胞器和蛋白质。微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）是自噬体形成的关键标志物，它以微管相关蛋白1A/1B-轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3-I）和微管相关蛋白1轻链3的脂化形式（lipidated form of microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3-Ⅱ）2种形式存在，LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ是自噬体形成的必要步骤[43-44]。Li等[29]使用苍术素处理乳腺癌MCF-7细胞时发现，苍术素可以增加了LC3Ⅰ向其脂化形式的LC3Ⅱ的转化，并增加了苄氯素1（beclin-1，BECN1）的表达，下调了人乳腺癌MCF-7细胞中的p62蛋白（p62 protein，p62）表达，改变凋亡和自噬相关生物标志物。Acharya等[45]研究发现，苍术素通过调节PI3K、AKT、mTOR、p38MAPK信号通路的活性，可以诱导胆管癌HuCCT-1细胞发生自噬，并抑制其生长、迁移和侵袭，SB202190（p38MAPK诱导剂）和3-MA（p38MAPK抑制剂）分别显著增加和降低苍术素诱导的自噬速率。 2.5 抑制肿瘤血管生成 血管生成本身不会导致恶性肿瘤的形成，但可以为肿瘤的生长和转移提供条件。肿瘤在发展到一定阶段后，需要依赖新生血管来满足其对氧气和营养的增加的需求，以及排除代谢废物，因此，抑制血管生成是一种有效的抗肿瘤策略[46]。血红素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）是一种在肿瘤组织中高表达的酶，它可以促进肿瘤的血管生成和抗氧化应激，为肿瘤细胞提供生存优势。因此，抑制HO-1的表达或活性是治疗肿瘤的另一种有效策略之一。Mathema等[47]研究发现，苍术素可以抑制胆管癌CL6肿瘤细胞的集落形成和伤口愈合能力，其机制与抑制HO-1的表达、下调信号转导及转录激活蛋白1/3（signal transducer and activator of transcription 1/3，STAT1/3）和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的信号通路有关。β-桉叶醇也具有抑制胆管癌细胞中HO-1的表达的能力，其机制与浓度依赖性地抑制STAT1/3和NF-κB信号通路有关[48]。β-桉叶醇还可以通过抑制生长因子信号通路中的环磷腺苷效应元件结合蛋白（cyclic-AMP response binding protein，CREB）激活来阻断血管生成，从而抑制肿瘤的发展[49]。Tsuneki等[50]有动物实验表明，β-桉叶醇可以通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）来刺激大鼠嗜铬细胞瘤细胞中的神经突生长，且β-桉叶醇还表现出了体外和体内的抗血管生成活性，其阻断了由碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）或血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）诱导的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）中CREB蛋白的磷酸化，从而抑制bFGF刺激的HUVEC迁移和HUVEC在基质胶中的管形成。同时，它还能显著降低小鼠皮下植入的Matrigel栓塞和小鼠佐剂诱导的肉芽肿中的血管生成[51]。 2.6 免疫调节作用 随着肿瘤的发生和发展，或在接受化疗、放疗等治疗的过程中，肿瘤患者机体免疫力的显著下降。因此，调节或刺激机体免疫能力，可能是一种有效的主动抗癌策略。免疫治疗作为一种新型的抗癌手段，已经引起了广泛的关注和研究[52]。巨噬细胞是机体内重要的免疫细胞，在机体免疫中发挥着重要的作用[53]。Qin等[54]从苍术中分离得到两种多糖成分：中性多糖和酸性多糖。研究表明，酸性多糖能够显著地刺激小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7）细胞的增殖、吞噬能力、NO产生和细胞因子分泌，并且呈现出剂量相关性，而中性多糖则相对较弱。此外，中性多糖和酸性多糖均能够激活淋巴结Peyers patch细胞中的T细胞，并促进集落刺激因子的产生。而酸性多糖也表现出比中性多糖更好的肠道免疫调节活性。吲哚胺-2,3-二氧化酶（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO）是一种通过犬嘌呤途径氧化分解色氨酸的限速酶，是抗肿瘤免疫治疗中小分子药物开发的潜在目标。IDO可在肿瘤微环境中通过与许多肿瘤相关的自发炎症和T细胞激活而被诱导。Liu等[55]研究发现，苍术内酯Ⅰ可以通过下调Toll样受体4/髓样分化蛋白2复合物（toll-like receptor 4/myeloid differentiation 2 complex，TLR4/MD-2）的表达，抑制人卵巢癌细胞（EOCSKOV3）中髓样分化主要反应蛋白88（myeloid differentiation primary response protein 88，MyD88）、NF-κB、Akt和IDO1的信号通路的活化，从而减少白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、转化生长因子-β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）、VEGF和白细胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）等促进肿瘤免疫逃逸的因子的分泌。同时，还可以降低调节性T细胞（Treg细胞）在肿瘤微环境中的比例，改善T淋巴细胞受到EOCSKOV3细胞上清液抑制而导致的增殖反应降低和抗肿瘤细胞毒性减弱。Liu等[56]研究发现，苍术内酯Ⅲ可以通过直接结合JAK3蛋白，从而抑制γ-干扰素（interferon gamma，IFN-γ）触发的JAK3/STAT3通路，从而达到抑制IDO激活的目的。 苍术抗肿瘤成分的潜在分子机制见图2。对苍术抗肿瘤有效成分及其抗肿瘤作用进行归纳总结，见表2。 图片 图片 3 联合用药 西医治疗肿瘤的常用手段有手术切除、药物化疗和高能射线放疗等，这些手段去除肿瘤西医的治疗方式更为直接，适合前期控制病情，化疗药物虽然能够杀死肿瘤细胞，但同时也伴有严重的副作用，影响患者的生活质量和治疗效果。中药具有不良反应小、安全性高的特点，因此中药与化疗药物的联合应用被广泛关注和探索[57]。 阿帕替尼是全球第一个在晚期胃癌被证实安全有效的小分子抗血管生成靶向药物，也是晚期胃癌标准化疗失败后，明显延长生存期的单药。Zhou等[58] 分析了不同苍术多糖提取方法的影响。比较了热水浸提法、超声浸提法和酶浸提法提取苍术多糖的得率、总糖含量、相对分子质量分布、单糖组成、并测定苍术多糖与阿帕替尼的协同活性。结果发现其中超声浸提法表现出最强的协同作用。这也与超声浸提的苍术多糖相对分子质量小、β-构型高、半乳糖含量高的事实相一致。Srijiwangsa等[59]发现，β-桉叶醇可以通过抑制胆管癌细胞和细胞裂解物中的NAD（P）H醌氧化还原酶1[NAD（P）H quinonedehydrogenase 1，NQO1]的活性和蛋白表达，增强氟尿嘧啶和多柔比星对细胞迁移的细胞毒性活性和抑制活性。Mai等[60]将不同浓度的苍术内酯I、硼替佐米以及硼替佐米+苍术内酯I作用于U266细胞结果研究发现，苍术内酯可以调节JAK2/STAT3通路上的IL-6、JAK2、STAT3等基因表达抑制U266肿瘤细胞的增殖和促进其凋亡并呈剂量依赖性，并能与硼替佐米产生协同作用，当苍术内酯I与硼替佐米联合使用时，可显著增强对U266细胞增殖的抑制作用。 紫杉醇是第一个获得批准的草药衍生化疗药物[61]。并且作为一种已知的Toll受体4配体（toll-like receptor 4 ligand，TLR4），可激活TLR4/MyD88依赖性途径，该通路介导了上皮性卵巢癌的化学耐药性和肿瘤进展。苍术内酯I是一种新型TLR4拮抗剂，通过干扰紫杉醇与人白细胞膜TLR4的结合，来抑制TLR4信号传导。Huang等[62]研究发现苍术内酯-I可以减弱紫杉醇诱导的IL-6、VEGF和存活蛋白的蛋白表达，并增强MyD88（+）EOC人卵巢癌细胞的早期凋亡和生长抑制；苍术内酯I被发现更加亲和人髓样分化蛋白2（myeloid differentiation 2，MD-2）的疏水囊，并通过对接模拟与紫杉醇的结合位点部分重叠，这表明苍术内酯-I可能阻断MyD88（+）EOC细胞中MD-2介导的TLR4/MyD88依赖性紫杉醇信号传导。因此，苍术内酯-I可以通过阻断MD-2介导的TLR4/MyD88信号传导，显著提高MyD88（+）EOC细胞对紫杉醇的反应。 结缔组织生长因子（connective Tissue Growth Factor，CTGF）是一种多功能信号调节剂，可通过调节细胞增殖、迁移、侵袭、耐药性和EMT来促进癌症的发生、进展和转移。CTGF还参与大多数节点的肿瘤微环境，包括血管生成、炎症和肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）激活[63]。Wang等[64]研究发现，苍术内酯-I可以下调三阴性乳腺癌细胞中CTGF的表达和分泌。除了通过CTGF抑制三阴性乳腺癌细胞迁移外，苍术内酯-I还下调了成纤维细胞中CTGF的表达，降低了乳腺癌细胞将成纤维细胞转化为CAFs的能力，从而增加了三阴性乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性。在小鼠肿瘤模型中，发现苍术内酯-I治疗可以增强紫杉醇对肿瘤的化疗作用，减少肿瘤向肺和肝的转移。在用苍术内酯-I与紫杉醇联合治疗的小鼠中，源自接种肿瘤的原代培养的成纤维细胞表达相对较低水平的CAFs标志物。 研究表明了苍术内酯-I可以通过阻断CTGF表达和成纤维细胞活化来使三阴性乳腺癌细胞对紫杉醇敏感，还可以通过阻断MD-2介导的TLR4/MyD88信号传导，显著提高肿瘤细胞对紫杉醇的反应并。这些机制有助于未来研究以确定苍术内酯I在临床环境中的价值。对苍术化学成分联合治疗归纳总结，见表3。 图片 4 结语与展望 苍术中含有多种抗肿瘤成分，其中多为倍半萜类成分，如苍术酮、苍术素和苍术内酯等，这些成分多是通过调控PI3K/Akt/mTOR通路来发挥抗肿瘤的作用，但作用靶点与方式却各不相同。例如苍术内酯主要通过降低Akt的磷酸化水平、上调Bax和Bad蛋白表达、增加脂质磷酸酶（PTEN）活性来抑制该通路进而诱导肿瘤细胞凋亡[20]；β-桉叶醇能通过激活p27抑制cyclinD1和CDK4蛋白表达最终导致细胞周期停滞于G1期[19]。这些成分通过多途径、多靶点影响肿瘤细胞的生存、运动、代谢和迁移进而共同发挥抗肿瘤作用。正因为其作用机制的不同，使其各有效成分对不同肿瘤的作用具有一定特异性。因此苍术抗肿瘤活性成分联合化疗药物减副增效在科学研究及临床用药时可根据其作用机制进行选择。目前关于苍术化合物对肿瘤细胞的研究还存在一些不足之处，如缺乏对不同肿瘤细胞类型和不同剂量的系统比较、缺乏对苍术化合物与其他药物或放化疗的协同作用的评价，以及缺乏对苍术化合物在体内代谢和药效学的深入分析等。 因此，今后还需要加强对苍术化合物抗肿瘤作用的基础和临床研究。后续可以根据苍术有效成分的抗肿瘤作用机制，筛选出具有最强抗肿瘤活性和最低毒性的化合物，作为候选药物进行进一步的优化和改造，提高其药效和安全性；分析苍术中有效成分的药代动力学特征，研究其在体内的吸收、分布、代谢和排泄等过程，确定其最佳的给药途径、剂量和方案，减少其不良反应和药物相互作用；根据苍术中有效成分的药效学特征，研究其对不同类型、分期和分子标志物的肿瘤细胞的作用差异，确定其最适合的治疗对象和指标，提高其个体化和精准化的治疗效果；根据苍术有效成分的协同增效或拮抗作用，探索其与其他抗癌药物或放化疗的联合应用，实现其对肿瘤细胞的多靶点、多途径和多机制的综合干预，增强其抗肿瘤效能和克服肿瘤耐药性，以期为开发新型的抗肿瘤药物提供更多的选择和可能性。 苍术与化疗药物的联合应用被广泛关注和探索。作为苍术的主要成分，现有研究已表明倍半萜类具有显著的抗肿瘤活性，其与化疗药物的联合临床用药有着巨大的潜力。但倍半萜类化合物分子结构中含有多个疏水基团，导致它们的极性较低，难以与水分子形成氢键或静电相互作用，在水中的溶解度小、生物利用度低。随着现代药物研究技术的现代化和多学科的交叉融合，这些问题也可以通过引入基团、采用纳米技术制备纳米载体、采用共晶技术制备倍半萜类化合物的共晶体等方式来提高其水溶性，进而增强其生物利用度。这些技术在药物化学领域已比较成熟，也已逐步应用于临床药物的开发。例如，抗疟活性药物青蒿素同样具有水溶性差应用困难的问题，通过引入羧酸基团，显著提高了其水溶性和生物利用度[65-66]； 此外，共晶体可以改变倍半萜类化合物的晶型和晶格参数，从而降低其结晶度和熔点，增加其自由能和溶解度[67]。苍术内酯也可通过与尼可替尼（一种具有较高水溶性的抗肿瘤药物）制备共晶体，可以显著提高其水溶性。因此，苍术抗肿瘤有效成分和化疗药物的联合用药在临床环境中的开发和应用具有很高的研究价值。 苍术作为中医临床常用的化湿药。其药性辛、苦、温，归脾、胃、肝经，其苦温燥湿，可以去湿浊、辛温健脾以和脾胃，多用于湿