样品制备

岩相样品切片、减薄的制备技术交流之二——岩相样品制备SOP 一、岩相样品的粘结 ● 用MetLab的中型METCUT-10或大型METCUT-12A，甚至20A的砂轮切割机，将大尺寸的岩相样品统一切割至适合载玻片的长、宽、厚度。 ● 或者，用MetLab的岩相精密切割&研磨一体机METCUT-10GEO，将真空卡盘换装机械夹具（工作台的T型槽是8mm，所以夹具的T型一定要配8mm的），固定好岩相样品后，摇动切割手轮，沿Y轴（纵向）进行切割，切割出想要的薄片。 ● 在合适材质（如，氧化铝，碳化硅，金刚石等）的平面研磨磨石、或磨盘、或薄膜、或砂纸上，将切好的岩相样品的非研究面预磨出一个哑光表面，以此创建一个与载玻片粘合的表面。 ● 在工作台上铺一张油脂薄膜或纸。取出载玻片。如果同时制备多个样品，则将长、宽、厚度相同的载玻片排列开来。载玻片的尺寸较多，常用尺寸为27x46mm，这个尺寸是和岩相精密切割&研磨一体机的真空卡盘尺寸相匹配的。 ● 建议使用QMAXIS（可脉）的环氧树脂和固化剂作为粘结剂——其中，无孔隙的岩相样品，用EpoQuick系列；而有孔隙样品，则选用EpoFlow系列——按标签提示的比例混合，倒入混合蜡纸杯中，用搅拌棒缓慢地搅拌约2分钟。 ● 首例描述无孔隙的岩相样品。将混合好的EpoQuick环氧树脂和固化剂均匀地涂抹在岩相样品的非研究面，反过来放在载玻片上，轻轻地前后移动压挤，去除所有气泡。用搅拌棒刮掉载玻片上挤压出的环氧树脂。 ● 将粘结好的岩相样品放在薄片样品粘结台METBOND GEO上，利用压簧压实后静置约2小时。METBOND GEO是带加热板的薄片样品粘结台，为了加快树脂固化的速度，可以打开加热开关，在控制面板上设定温度即可。如果没有配置MetLab的METBOND GEO——也就是没有加热板的薄片粘结台——可以将薄片样品粘结台放置在60°C左右的热板上加热，或者在室温条件下自然固化。 ● 当然，粘结剂也可以选用QMAXIS（可脉）的Mounting Adhesive热熔胶。将载玻片和岩相样品（非研究面朝上）放在加热台上，加热到100-120℃时，用热熔胶棒均匀地涂抹岩相样品的非研究面和载玻片，观察热熔胶完全熔化后，将岩相样品的非研究面粘到载玻片上，移至薄片样品粘结台，压实后静置至完全冷却。 ● 注意，薄片粘结台是选配件，需要单独购买。它不仅可以压实样品，而且可以精确地控制样品与载玻片之间粘结剂的厚度，这为消除样品和载玻片的公差，使多片样品制备一致提供了基础。 ● 第二例描述的是更普遍存在的多孔隙的岩相样品，这时必须调整粘结技术。选择合适尺寸的橡胶注模杯，将岩相样品研究面朝下放入橡胶注模杯中，将EpoFlow环氧树脂和固化剂按标签所示比例倒入混合蜡纸杯中，用搅拌棒缓慢搅拌约2分钟后，把蜡纸杯放入QMAXIS（可脉）的Air-Out真空系统，抽真空——放气——抽真空，循环操作3-4次。最后一次放气后，打开Air-Out穹顶盖，将蜡纸杯中的混合液倒入橡胶注模杯中。再把橡胶注模杯放入Air-Out腔体内，同样地抽真空——放气——抽真空，循环操作3-4次，最后一次抽完真空后，关闭真空泵，保持真空静置8-10小时。上述两轮操作，使树脂液和样品中的空气被彻底排除。树脂液浸渗至岩相样品的孔隙中，支撑样品结构，使下一步切片和研磨减薄操作不会损伤样品的结构。 ● 当环氧树脂完全固化后，从橡胶注模杯中取出镶嵌块，对镶嵌块的非研究面进行研磨找平。然后按EpoQuick的同样步骤，将镶嵌块的非研究面粘到载玻片上。 ● 如果镶嵌块的长、宽、厚度超出载玻片，可以对镶嵌块进行切割、研磨整理。 二、岩相样品的切片 MetLab的岩相精密切割&研磨一体机METCUT-10GEO的切割和研磨分列于设备的两侧，一个电机，两侧同轴，保持切割、研磨的平行性高度一致。 ● 未开机前，先安装金刚石切割片。将METCUT-10GEO左侧切割室的透明防护罩向上开启——这种开启方式的设计节省了空间，方便使用者进行操作。取出10in（254mm）的金刚石切割片，其轴心孔径1.25in（31.75mm）。用随机工具卸下切割侧主轴上的法兰，按切割片顺时针的旋转方向（QMAXIS的Logo朝外即可），套入切割片。扣上法兰，锁紧螺母。 ● 打开METCUT-10GEO主开关。触摸屏首页出现MetLab的Logo时，触摸屏幕任意位置，进入操作主菜单页面。 ● 装上样品。点击主菜单上切割侧的真空开关（2），将粘结好岩相样品的载玻片的一面贴到真空卡盘表面，真空卡盘吸住载玻片。小尺寸的真空卡盘，有三个突出螺钉辅助将较小尺寸的载玻片进行位置确认。 ● 定位切割位置。切割侧的真空卡盘安装在工作台上的卡盘座上，利用测微计旋钮驱动工作台沿X轴（横向）左右移动。测微计旋钮一个刻度是0.005mm，旋转一圈移动1mm。X轴总行程是20mm，满足任何薄片样品的厚度调节。通过测微计旋钮，使样品与切割片保持正确的左右距离，即找准想要的切割位置。 ● 关闭切割室防护罩。防护罩的磁性安全开关锁闭防护罩。 ● 在触摸屏控制面板设置切割片转速（4）。转速100-3000rpm/min，增量1rpm/min。既可以点击箭头调升、调降，也可以用数字键盘输入转数值。点击切割侧的冷却水开关（5），冷却水流出，按下切割/研磨开关键（1），电机驱动金刚石切割片旋转。 ● 手动控制切割。匀速地顺时针摇动切割手轮，整个工作台沿Y轴（纵向）方向逐渐靠近切割片，开始切割。Y轴的总行程224mm，满足所有标准载玻片尺寸的长度方向通过。手动控制的优势是使用者操控的自由度大，不同材料、不同制备要求的薄片切割都可以自主调节。 ● 样品切割的保留厚度最薄约0.5mm。 ● 切割完成后，再次点击切割/研磨开关（1）、切割侧冷却水开关（5），切割电机停止旋转，冷却水关闭。逆时针摇动手轮，将样品离开金刚石切割片。 ● 开启切割室仓门，点击切割侧的真空开关（2），真空泵被关闭，从真空卡盘处取下载玻片，并从切割室工作台上取出被切割掉的样品。 ● 用水清洗载玻片及样品，准备研磨。 三、岩相样品的研磨 ● 同样地，开机前先安装金刚石杯形砂轮。金刚石杯形砂轮直径10in（250mm），轴心孔径1.25in（31.75mm）。标准配置的金刚石杯形砂轮是70μm的和30μm的。通常由粗到细研磨，先安装去除量较大的70μm的。将METCUT-10GEO右侧研磨室的防护罩向上开启。用随机工具卸下主轴的法兰，套入金刚石杯形砂轮（金刚石研磨面朝外），重新扣上法兰，锁紧螺母。 ● 打开METCUT-10GEO的主开关。同样地，触摸Logo页面的任意位置进入操作主菜单页面。 ● 装上样品。研磨侧的真空卡盘固定在研磨操作手柄同轴的研磨臂上。研磨手柄在研磨室的外面，研磨臂在研磨室内。点击研磨侧真空开关（3），将已经切割好的样品载玻片的一面贴到研磨侧真空卡盘表面。真空卡盘吸附住载玻片。 ● 定位研磨起始位置。调整研磨操作手柄的位置，使样品与金刚石杯形砂轮的金刚石表面相对应。逆时针旋转研磨手柄末端的测微计（数字千分尺），当样品表面接触到金刚石杯形砂轮的表面时，按下千分尺的清零键。向后拉下研磨操作手柄，使样品离开金刚石砂轮的表面。 ● 关闭研磨室防护罩。该防护罩也有磁性安全开关装置，锁闭防护罩。 ● 在触摸屏面板设置金刚石杯形砂轮的转速（4）。转速的设定同切割侧。点击研磨侧冷却水开关（6），冷却水流出。点击切割/研磨开关键（1），电机驱动金刚石杯形砂轮旋转。 ● 握住研磨操作手柄前后韵律地移动，使样品的表面均匀地摩擦旋转的金刚石杯形砂轮，随着样品被磨削减薄，用手逆时针旋转千分尺，使样品持续贴近金刚石杯形砂轮。在千分尺数显200μm之前，千分尺的每次进给10-20μm即可；在千分尺数显200μm后，进给调整为5-10μm，直至千分尺数显为70μm。 ● 当达到70μm厚度时（扣除粘结的树脂厚度，样品实际厚度约60μm），停止手柄的研磨操作。点击切割/研磨开关（1）、研磨侧冷却水开关（6），金刚石杯形砂轮停止旋转，研磨侧冷水停止流出。将研磨手柄向身体侧拉，是样品离开金刚石杯形砂轮。 ● 打开研磨室防护罩，点击研磨侧真空开关（3），关闭真空泵，取下样品。 ● 从上述第一步开始，重复实施30μm的金刚石杯形砂轮研磨减薄动作。有时，观察需要更好的表面性，则停止了70μm的研磨后，转至磨抛机进行研磨、抛光。 ● 样品研磨减薄的保留厚度取决于研究目的，最薄约0.03mm。

透射电镜样品制备技术之生物样品制备流程透射电镜常用的50-100 kV电子束来说，样品的厚度控制在10～100 nm为宜。由于电镜产生的电子束穿透能力很弱，需要把标本切成厚度小于0.1 µ m以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片(Ultrathin sectioning)。常用的超薄切片厚度是50-70 nm，也可进行冷冻超薄切片。超薄切片技术是为透射电子显微镜观察提供薄样品的专门技术，研究材料类、生物类样品的基本技术，尤其是观察细胞、组织、器官等的超微结构以及亚细胞结构常用的技术。也是电镜细胞化学、免疫电镜等技术的关键性技术。它在生物学的发展过程中占据重要的地位，目前各种细胞、组织的超微结构知识几乎都是由它提供的。冷冻超薄切片机 Leica EM UC7制备流程取材→固定→脱水→包埋（渗透、包埋、聚合）→超薄切片→电子染色（生物类）取材→清洗→包埋（渗透、包埋、聚合）→超薄切片→电子染色（材料类）生物样品超薄切片要求：（1）细胞的细微结构保存良好，没有明显的物质凝聚、丢失、添加等人工效应；（2）切片厚度50-100 nm为宜：太薄反差低；太厚反差好，但结构重叠，电子束不能穿透；（3）切片应耐电子束的强烈照射，不变形不升华；（4）切片能够适当被染色，保证一定的反差；（5）切片均匀，无皱褶、刀痕，无染色剂或其他化学物质的沉淀。取材目地和要求（1）新鲜。(材料离体后1-5 min内进入固定液，避免细胞自溶和结构变化)（2）体积小。(厚度（3）机械损伤小。(动作轻巧，器械锋利，避免对组织的挤压和推拉，建议用剃须刀片、手术刀片、手术剪刀。)（4）低温操作，器械、容器、固定液均需预冷（降低酶的活性，减少组织自溶）。（5）取材部位准确，且注意材料的方向性和定位。固定目的和要求：终止组织细胞的生化过程同时把它们的超微结构改变控制在最小范围内，并保护这些结构在后续的脱水、包埋等过程中不被破坏；将蛋白、离子等内容物保留在原位，以便后续的研究。固定液：固定剂＋缓冲液（1）破坏细胞的酶活性系统（2）稳定细胞物质成分，并保存之（3）接近细胞生活状态的渗透压,使细胞不收缩或膨胀（4）在组分的分子之间建立交联，提供骨架稳定细胞器的空间构型（5）提供一定的电子反差固定剂：戊二醛（C5H8O2)：渗透性好，保存蛋白质、酶活性，稳定糖元，无电子染色作用，固定脂类和膜差。可长时固定（低温可达半年）。锇酸（OsO4)：强氧化剂，固定脂类、膜结构，有电子染色作用；破坏酶活性。多聚甲醛：优良地保存酶活性，用于细胞化学。缓冲液：仿效细胞外液成分，对细胞富有生理保护。维持稳定的pH值；提供适当的渗透压；提供适当的离子成分使样品不抽提，不沉淀。固定方法：常用双固定法，用戊二醛对样品前固定，漂洗后使用锇酸对样品进行后固定。影响因素： 1.pH值：动物组织7.2-7.4，植物6.8-7.0，高度含水组织8.0-8.4 2.缓冲液类型：磷酸缓冲液、二甲砷酸盐缓冲液等，0.05-0.1 mol/L 3.渗透压：KCl, NaCl, 蔗糖调节 4.固定剂浓度：戊二醛2-6%，四氧化锇1-2% 5.材料大小：0.5-1 mm³ 操作步骤：戊二醛固定液：有细胞壁的样品5%，无细胞壁样品3%。加入缓冲体系，确保生物样本内外渗透压，避免细胞萎缩或吸涨。切取一小块组织，置入预冷的戊二醛固定液（3-5%）中，4℃预固定20分钟后，捞出置于洁净的保鲜膜或培养皿上（已滴有预冷的固定液），在固定液中用将组织切成2-5 mm长， 2-3 mm宽， 1 mm厚的细条，移入盛有预冷的戊二醛固定液的离心管中，4 ℃固定过夜。1.植物细胞的细胞壁和液泡会阻碍固定液迅速渗入。植物材料内部存有的空气，往往使材料漂浮于固定液面之上，由此影响到植物组织的固定效果。组织放入戊二醛固定液后，可用真空泵抽出组织内部的气体，使材料沉入固定液中。2.动物样本的取材，可将动物麻醉或急性处死后切取组织。或者采用原位固定、流灌固定后再切取所需组织。3.细胞培养的样品，轻微并短暂离心，倒净培养液后，加入预冷的固定液，4℃固定10 min后，低温6000 rpm/min离心5 min（离心力不可过大，离心时间不可过长，避免机械挤压），去上清，滴加新鲜固定液并重悬，4℃固定过夜。脱水用适当的有机溶剂取代组织和细胞中的游离态水分，使之能与包埋剂混合。要求：脱水要彻底；更换液体动作要迅速；脱水时间不宜过长；固定后的样品要充分漂洗。脱水剂：乙醇、丙酮、环氧丙烷等。步骤：逐级梯度脱水30％→50％→70％→80％→90％→95％(以上步骤每次15-20 min)→100％(2-3次，每次15 min)→100％丙酮(20 min) 包埋1.渗透：用包埋剂或混合液逐渐取代组织内的脱水剂（或前介质），使细胞内外所有的空隙被渗透液填充，使包埋剂逐步渗透到组织细胞内部,以便与细胞外的包埋剂同时聚合。包埋剂：聚合有良好的切割性能，软硬度易调节粘度低，易渗透；溶于脱水剂；电子透明度好，并具有一定的反差，聚合要充分、均匀，聚合温度要尽可能低；本身无结构，热稳定性好，可耐电子束轰击；来源丰富，且各批号性能尽可能一致；切片易染色,且对人体无害。常用Epon 812、Spurr、LR white等步骤：逐级梯度渗透，脱水剂:包埋剂3:1 → 1:1 → 1:3 →纯包埋剂2.包埋：将渗透好的样品块放入到适当的包埋模具中，灌装上纯包埋剂包埋。3.聚合：加温聚合形成固体基质，牢固地支撑整个细胞结构或组织，制成适于机械切割的固体包埋块，利于切片。步骤：37℃(12 h)→45 ℃(12-48 h)→60 ℃(24-48 h)超薄切片制刀：常用玻璃刀、钻石刀。刀上要装水槽，并注入槽液。槽液要求：不与材料发生化学反应，干净无杂质；液面与刀口基本平行；低粘度,蒸发量小；有一定的表面张力,有利于漂浮切片。常用的槽液：双蒸水、二甲基亚砜（DMSO）、甘油水溶液等。修块：除去组织周围多余的包埋介质和不感兴趣的部分，以提供较大的有效观察面积。并修成一定形状、大小的包埋块截面，便于连续切片。可手工、机械修块。切片：装块→装刀→对刀→加水→切片→捞片注意事项：对刀是关键；槽液用新鲜溶液；温度20~25℃，相对湿度60%；室内无空气流动，清洁，防止震动；刀槽密封，否则漏水。电子染色利用高密度的重金属染色剂（铅、铀）与细胞某些微细结构或成分结合，以增加样品局部的电子散射能力，提高电镜图像反差的方法。染色实质上是增大电子密度，电镜图像灰度不同。电子显微镜图片均为黑白灰，无彩色。常用染色剂：醋酸铀：主要染核酸、核蛋白、细胞核、结缔组织。要避光，有微弱的放射性柠檬酸铅：主要染膜结构、脂类、核酸。易与CO2反应成沉淀，染色中应避免。步骤：单染：铅盐单染,铀盐单染。双染色：醋酸双氧铀染色→漂洗→柠檬酸铅染色→漂洗→干燥。双染色较为常用。材料样品取材后可用丙酮清洗样品表面，直接包埋（渗透、包埋、聚合），超薄切片、电子染色（锇酸熏染）。

在人类享受科技带来的快速发展的同时，也同样面临着其带来的惩罚，越来越严峻的环境问题，以及频繁的食品安全问题。严峻的势态，人们的忧虑及国家的重视，导致需要监控、分析的样品种类及数量迅速增加，对分析实验室的要求也越来越高。样品制备是现代色谱分析中最重要的过程，这一过程占据了整个色谱分析61%的时间以及30%的误差来源。另外，操作人员技术水平的参差不齐让分析结果的准确性与精密度无法得到保证，随着样品数量的增加，操作人员的作业负荷也随之增加，并且长时间接触有机溶剂也危害着实验人员的健康。安全隐患及人力成本的增加，未来分析实验室势必朝着自动化、信息化、智能化方向发展，如何让样品前处理更加自动化，信息化，智能化是睿科一直在努力的。此次由睿科研究院产学研研制出的新品-ISP600多功能样品制备工作站就能全自动的完成QuEChERS方法样品制备全流程，实验室实现无人值守不再是梦想。点击在线观看ISP600在：北京BCEIA展会现场操作视频睿科ISP系列多功能样品制备工作站建立在六轴机械手平台上，集合样品管理，液体处理，开关盖，震荡提取，离心分离等五大模块，使其达到样品制备过程无人化，而人工只需承担简单的制样与称样的工作，大大减少了样品制备过程中人工操作带来的影响，解放实验人员劳动力及提高分析结果准确度。高通量每批次六个样品同时运行，批次间步骤交叠运行，一天最少处理120个样品全自动完全无人化工作，人工只需完成样品称量以及色谱上样的工作精确性机械化运行，无人工干扰，保证处理过程一致性以及数据的精密性与准确性安全性节约溶剂，避免实验人员与溶剂接触应用领域农业：植物源性食品中以农残为主的农药检测应用举例GB23200.108-2018 植物源性食品中草铵膦残留量的测定 液相色谱-质谱联用法GB23200.109-2018 植物源性食品中二氯吡啶酸残留量的测定 液相色谱-质谱联用法GB23200.110-2018 植物源性食品中氯吡脲残留量的测定 液相色谱-质谱联用法GB23200.111-2018 植物源性食品中唑嘧磺草胺残留量的测定 液相色谱-质谱联用法GB23200.112-2018 植物源性食品中9种氨基甲酸酯类农药及其代谢物残留量的测定 液相色谱-柱后衍生法GB23200.113-2018 植物源性食品中208种农药及其代谢物残留量的测定气相色谱-质谱联用法GB23200.115-2018 鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量的测定 液相色谱-质谱联用法