生物样品

透射电镜样品制备技术之生物样品制备流程透射电镜常用的50-100 kV电子束来说，样品的厚度控制在10～100 nm为宜。由于电镜产生的电子束穿透能力很弱，需要把标本切成厚度小于0.1 µ m以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片(Ultrathin sectioning)。常用的超薄切片厚度是50-70 nm，也可进行冷冻超薄切片。超薄切片技术是为透射电子显微镜观察提供薄样品的专门技术，研究材料类、生物类样品的基本技术，尤其是观察细胞、组织、器官等的超微结构以及亚细胞结构常用的技术。也是电镜细胞化学、免疫电镜等技术的关键性技术。它在生物学的发展过程中占据重要的地位，目前各种细胞、组织的超微结构知识几乎都是由它提供的。冷冻超薄切片机 Leica EM UC7制备流程取材→固定→脱水→包埋（渗透、包埋、聚合）→超薄切片→电子染色（生物类）取材→清洗→包埋（渗透、包埋、聚合）→超薄切片→电子染色（材料类）生物样品超薄切片要求：（1）细胞的细微结构保存良好，没有明显的物质凝聚、丢失、添加等人工效应；（2）切片厚度50-100 nm为宜：太薄反差低；太厚反差好，但结构重叠，电子束不能穿透；（3）切片应耐电子束的强烈照射，不变形不升华；（4）切片能够适当被染色，保证一定的反差；（5）切片均匀，无皱褶、刀痕，无染色剂或其他化学物质的沉淀。取材目地和要求（1）新鲜。(材料离体后1-5 min内进入固定液，避免细胞自溶和结构变化)（2）体积小。(厚度（3）机械损伤小。(动作轻巧，器械锋利，避免对组织的挤压和推拉，建议用剃须刀片、手术刀片、手术剪刀。)（4）低温操作，器械、容器、固定液均需预冷（降低酶的活性，减少组织自溶）。（5）取材部位准确，且注意材料的方向性和定位。固定目的和要求：终止组织细胞的生化过程同时把它们的超微结构改变控制在最小范围内，并保护这些结构在后续的脱水、包埋等过程中不被破坏；将蛋白、离子等内容物保留在原位，以便后续的研究。固定液：固定剂＋缓冲液（1）破坏细胞的酶活性系统（2）稳定细胞物质成分，并保存之（3）接近细胞生活状态的渗透压,使细胞不收缩或膨胀（4）在组分的分子之间建立交联，提供骨架稳定细胞器的空间构型（5）提供一定的电子反差固定剂：戊二醛（C5H8O2)：渗透性好，保存蛋白质、酶活性，稳定糖元，无电子染色作用，固定脂类和膜差。可长时固定（低温可达半年）。锇酸（OsO4)：强氧化剂，固定脂类、膜结构，有电子染色作用；破坏酶活性。多聚甲醛：优良地保存酶活性，用于细胞化学。缓冲液：仿效细胞外液成分，对细胞富有生理保护。维持稳定的pH值；提供适当的渗透压；提供适当的离子成分使样品不抽提，不沉淀。固定方法：常用双固定法，用戊二醛对样品前固定，漂洗后使用锇酸对样品进行后固定。影响因素： 1.pH值：动物组织7.2-7.4，植物6.8-7.0，高度含水组织8.0-8.4 2.缓冲液类型：磷酸缓冲液、二甲砷酸盐缓冲液等，0.05-0.1 mol/L 3.渗透压：KCl, NaCl, 蔗糖调节 4.固定剂浓度：戊二醛2-6%，四氧化锇1-2% 5.材料大小：0.5-1 mm³ 操作步骤：戊二醛固定液：有细胞壁的样品5%，无细胞壁样品3%。加入缓冲体系，确保生物样本内外渗透压，避免细胞萎缩或吸涨。切取一小块组织，置入预冷的戊二醛固定液（3-5%）中，4℃预固定20分钟后，捞出置于洁净的保鲜膜或培养皿上（已滴有预冷的固定液），在固定液中用将组织切成2-5 mm长， 2-3 mm宽， 1 mm厚的细条，移入盛有预冷的戊二醛固定液的离心管中，4 ℃固定过夜。1.植物细胞的细胞壁和液泡会阻碍固定液迅速渗入。植物材料内部存有的空气，往往使材料漂浮于固定液面之上，由此影响到植物组织的固定效果。组织放入戊二醛固定液后，可用真空泵抽出组织内部的气体，使材料沉入固定液中。2.动物样本的取材，可将动物麻醉或急性处死后切取组织。或者采用原位固定、流灌固定后再切取所需组织。3.细胞培养的样品，轻微并短暂离心，倒净培养液后，加入预冷的固定液，4℃固定10 min后，低温6000 rpm/min离心5 min（离心力不可过大，离心时间不可过长，避免机械挤压），去上清，滴加新鲜固定液并重悬，4℃固定过夜。脱水用适当的有机溶剂取代组织和细胞中的游离态水分，使之能与包埋剂混合。要求：脱水要彻底；更换液体动作要迅速；脱水时间不宜过长；固定后的样品要充分漂洗。脱水剂：乙醇、丙酮、环氧丙烷等。步骤：逐级梯度脱水30％→50％→70％→80％→90％→95％(以上步骤每次15-20 min)→100％(2-3次，每次15 min)→100％丙酮(20 min) 包埋1.渗透：用包埋剂或混合液逐渐取代组织内的脱水剂（或前介质），使细胞内外所有的空隙被渗透液填充，使包埋剂逐步渗透到组织细胞内部,以便与细胞外的包埋剂同时聚合。包埋剂：聚合有良好的切割性能，软硬度易调节粘度低，易渗透；溶于脱水剂；电子透明度好，并具有一定的反差，聚合要充分、均匀，聚合温度要尽可能低；本身无结构，热稳定性好，可耐电子束轰击；来源丰富，且各批号性能尽可能一致；切片易染色,且对人体无害。常用Epon 812、Spurr、LR white等步骤：逐级梯度渗透，脱水剂:包埋剂3:1 → 1:1 → 1:3 →纯包埋剂2.包埋：将渗透好的样品块放入到适当的包埋模具中，灌装上纯包埋剂包埋。3.聚合：加温聚合形成固体基质，牢固地支撑整个细胞结构或组织，制成适于机械切割的固体包埋块，利于切片。步骤：37℃(12 h)→45 ℃(12-48 h)→60 ℃(24-48 h)超薄切片制刀：常用玻璃刀、钻石刀。刀上要装水槽，并注入槽液。槽液要求：不与材料发生化学反应，干净无杂质；液面与刀口基本平行；低粘度,蒸发量小；有一定的表面张力,有利于漂浮切片。常用的槽液：双蒸水、二甲基亚砜（DMSO）、甘油水溶液等。修块：除去组织周围多余的包埋介质和不感兴趣的部分，以提供较大的有效观察面积。并修成一定形状、大小的包埋块截面，便于连续切片。可手工、机械修块。切片：装块→装刀→对刀→加水→切片→捞片注意事项：对刀是关键；槽液用新鲜溶液；温度20~25℃，相对湿度60%；室内无空气流动，清洁，防止震动；刀槽密封，否则漏水。电子染色利用高密度的重金属染色剂（铅、铀）与细胞某些微细结构或成分结合，以增加样品局部的电子散射能力，提高电镜图像反差的方法。染色实质上是增大电子密度，电镜图像灰度不同。电子显微镜图片均为黑白灰，无彩色。常用染色剂：醋酸铀：主要染核酸、核蛋白、细胞核、结缔组织。要避光，有微弱的放射性柠檬酸铅：主要染膜结构、脂类、核酸。易与CO2反应成沉淀，染色中应避免。步骤：单染：铅盐单染,铀盐单染。双染色：醋酸双氧铀染色→漂洗→柠檬酸铅染色→漂洗→干燥。双染色较为常用。材料样品取材后可用丙酮清洗样品表面，直接包埋（渗透、包埋、聚合），超薄切片、电子染色（锇酸熏染）。

八戒：猴哥救我！悟空：呆子，何事慌张！八戒：猴哥你没听说吗！非洲猪瘟来了，一个被传染，一窝都遭殃啊！我听说辽宁、黑龙江、吉林、江西、福建、四川好多兄弟都已经被扑杀了。悟空：呆子！那还不离我远点！问题一、什么是非洲猪瘟？非洲猪瘟（African Swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African Swine fever virus，ASFV）感染家猪和各种野猪（不传染人）引起一种急性、出血性、烈性传染病。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100%，且只能依靠实验室监测确诊。 2018年8月3日我国确诊首例非洲猪瘟疫情。问题二、目前在中国的传染范围？自8月初我国首次发现非洲猪瘟以来，截至11月22日，全国有20个省份47个市（区、盟）发生73起家猪疫情、1起野猪疫情，累计扑杀生猪60万头。全国非洲猪瘟疫情呈现多点散发状态，但在各地动物疾控部门的积极行动下，疫情开始趋于平稳，总体防控有效。问题三、非洲猪瘟检测的样品处理方法介绍一、非洲猪瘟样品处理1. 目的规范ASFV样品和实验材料的处理程序，保证ASFV相关实验的顺序开展和实验室的生物安全。2. 适用范围适用于疑似ASFV临床样品的实验前的处理3. 程序3.1实验材料ASF的易感动物，主要为家猪、野猪和蜱，通常采集的样品为家猪、野猪的血液样品、组织样品以及蜱三类。田间采集的样品通常需要经过简单的预处理，才能进行后续的检测、诊断工作。血清：用于病毒核酸检测、病毒抗原和抗体检测。将采好的猪血的注射器或采血管在室温下倾斜静止2~4h（防止暴晒），或置于37℃温箱内1h，待大部分血清析出后，取出血清，必要时经离心分离血清。（最低建议量5ml）。抗凝全血：用于病毒核酸检测和病毒抗原检测。采血前，在真空采血管或注射器内按比例加入抗凝剂。采集血液，轻轻上下颠倒，使血液与抗凝剂充分混匀，防止血液凝固的同时避免溶血。也可以将血液放入装有玻璃珠的灭菌瓶内，震荡脱落纤维蛋白。必要时，可加入双抗以抑制血源性或采血过程中可能出现的细菌污染。当血样用于病毒核酸检测时，一般不用肝素而选用EDTA作为抗凝剂。（最低建议量1mL）。组织样本：活体采集，采用扁桃体，用于临床健康动物ASF监测。尸体剖检ASF发病动物或死亡动物经解剖取材，包括：ASFV靶器官的采集：脾脏、淋巴结、肾脏、扁桃体。其他病变组织脏器的采集：采集具有明显病变的肝脏、肺脏、心脏等组织器官，选取部位在病变和健康组织交界处。腐败动物尸体的样品采集：剖检取股骨，将附着的肌肉和韧带等全部剔除，采集骨髓。最低建议量5克。蜱的采集：蜱可进行核酸检测、抗原检测和蜱的形态学鉴定，查找猪圈的墙边、墙缝、木质或瓦质的屋顶，或挖掘猪圈地面均可能找到蜱，也可查看猪表皮，采集蜱。1-1样品保存条件注：用于病毒分离和病理学检测的样品禁止-20℃保存。3.2实验器材和试剂 1）台式高速冷冻离心机、组织研磨仪、水浴锅、计时器、冰箱和移液器等。2）无菌的剪子、镊子、钢珠、2mLEP管、移液器吸头（10μL,200μL、1000μL）等。3）其他试剂和耗材主要包括：0.01mol/L PBS（PH7.2）、0.8%NaOH、75%酒精棉球等。3.3样品处理程序3.3.1血清及全血样品处理取血清或全血样品1mL于灭菌EP管里，保存备用3.3.2组织样品处理适用于脾脏等组织样品和蜱的处理。尽可能减少污染，每取一个组织块或蜱，用火焰消毒剪镊等取样器械，组织块应分别放入灭菌容器内并立即密封，做好标记，注意防止组织间相互污染。3.3.2.1组织样品的处理应在二级生物安全柜中进行，勿使液体溅到生物安全柜中。3.3.2.2将0.1-0.2g组织块放入2mLEP管中，用剪刀剪成碎块，加1-2mL0.01mol/L PBS（PH7.2）,再加入1-2粒灭菌钢珠，密封后，表面消毒备用。剩余样品放回容器内，重新密封，表面消毒后保存-70℃冰箱。3.3.2.3组织样品的破碎可以利用组织研磨仪在生物安全柜外操作，将样品制成组织悬液。重磅推荐使用Scientz-48L冷冻型高通量组织研磨器3.4病毒灭活病毒的灭活处理应在二级生物安全柜中进行，将处理好的血清、全血或者研磨破碎后的组织样品连同EP管放入60℃水浴中，放置30min灭活。3.5使用后仪器处理剪刀、镊子等均应放入消毒缸进行消毒，放入铁饭盒内，并装入密封袋内进行高压灭菌处理。装有组织样品保存液的容器和盛有组织块的离心管应密封管口，表面消毒后放入密封袋中高压灭菌。钢珠、吸头等废弃物应用0.8%NaOH浸泡30分钟消毒后，置密封袋内高压灭菌。消毒残液应装入密封容器内高压灭菌处理。3.6注意事项操作之前要确认生物安全柜和实验室已进行了彻底的卫生消毒处理，防止样品间交叉感染。二、非洲猪瘟病毒的核酸检测可用实时荧光PCR配套相应实际进行，具体操作步骤以仪器生产公司指南为准。 问题四、病毒杀灭和防控方式非洲猪瘟病毒虽然在环境中比较稳定，但在猪肉烹煮处理过程中较易失活，70℃-75℃加热30分钟以上，病毒就会被杀灭，也就是说我们日常烹饪过程中只要把猪肉熟透(包括最中间部位温度至少达到70℃以上)，即使有病毒也会很快失去感染力并丧失活性。 新芝生物Scientz-48L冷冻型高通量组织研磨器介绍新芝生物推出的Scientz-48L冷冻型高通量组织研磨器具备以下特征：1.应用场景多样。可以对不同组织进行干磨、湿磨、混合以及均质化处理。2.实验效率高。能提高提取大通量样品中核酸的效率和质量。3.实验过程安全。研磨过程采用封闭式一次性离心管，有效地避免了样品交叉污染。4.仪器稳定性好。对同一组织样品可设定相同的研磨程序，从而获得相同的研磨效率，提高了实验的可重复性。5.研磨效果好。产品采用高效研磨球进行研磨，相较于传统研磨方式对样品的研磨更为均匀、充分。目前，新芝生物Scientz-48L冷冻型高通量组织研磨器已助力沈阳、大连、朝阳、本溪、鞍山、锦州、葫芦岛等多地动物疾控中心用于非洲猪瘟检测实验的样品前处理。Scientz-48L冷冻型高通量组织研磨器高效、稳定、安全的仪器特性很好地解决了检测过程中检测样品数量多、实验一致性难以控制等问题，得到了广大用户的一致好评。产品用途1.适用于各种植物组织包括根、茎、叶、花、果、种子等样品的研磨破碎； 2.适用于各种动物组织包括大脑、心脏、肺、胃、肝脏、胸腺、肾脏、肠、淋巴结、肌 肉、骨骼等样品的研磨破碎； 3.适用于真菌、细菌等样品的研磨破碎； 4.适用于食品、药品成分分析检测的研磨破碎； 5.适用于易挥发样品包括煤炭、油页岩、蜡制品等样品的研磨破碎； 6.适用于塑料、聚合物包括PE、PS、纺织品、树脂等样品的研磨破碎。主要技术参数1.时间设定：1(秒)-9999(秒)2.频率设定：10—70Hz，即振荡300—2100次/min 3.额定功率：180W4.夹具行程：34mm(垂直)5.温度设置 : -20℃或者-30℃6.电磁锁控制开门7.样品容量：随机标配：铝合金适配器5ml 12孔，2ml 48孔 可选配：铝合金适配器2ml24孔8.电源需求：220V单相交流，宁波新芝生物科技股份有限公司（股票代码：430685）始创于1989年，公司总部位于宁波市国家高新区，注册资金6102万元，是全球知名的生物样品处理设备提供商，也是国内超声波技术应用探索的先行者。依托强大的科研技术实力，公司在超声波、温湿度、高低压、超低温等技术层面积累了丰厚的经验，并先后研究开发包括生物样品前处理仪器、分子生物学仪器、实验室洁净设备、冷冻干燥设备、工业防垢除垢设备、环保除藻防控设备在内的多款产品。公司始终坚持业界前沿的技术研究和应用开发，致力于为科研、教育、环保、医疗、制药、石化、农林、材料等领域客户提供先进的产品设备和行业解决方案。公司目前拥有宁波、杭州两地四大研发中心，拥有高水平研发人员数十人，专利60余项。公司曾多次承担国家科技部、发改委、卫生部重大科研项目，是国家发改委高技术产业化示范工程中心、科学仪器产业化基地、宁波企业工程（技术）中心。公司研制的高压气体基因枪一举打破国外技术垄断，填补国内相关领域空白，荣获浙江省科技进步二等奖。公司高度重视品牌培育和市场开拓，为更好地服务客户，公司在全国各地建有30余个办事处，办事处均配备销售工程师和售后工程师，可随时满足客户需求。全球超过15,000家实验室在使用新芝生物的产品，各类仪器设备市场保有量超过100,000台套，产品远销美、英、法、俄、日、韩等36个国家，公司年度销售收入突破1亿元人民币，已经成为国内乃至全球知名的生物样品制处理设备研制专家。新芝生物30年风雨兼程，以新致心，将继续致力于为各行业客户提供优质的产品和贴心的服务！

即时发布 上海 - 2012年1月11日 2012年1月11日，由沃特世（Waters® ）公司发起的&ldquo 沃特世生物样品分析研讨会&rdquo 在上海成功举办，来自上海地区生物分析领域的专家出席了此次会议。 当前，在分析血浆、尿液、这些复杂基质的生物样品时，面临的最大挑战就是基质效应，因此在进行LC/MS分析前如何选择最合适的前处理方法来消除&ldquo 离子抑制或离子增强&rdquo 作用成为科学家们最关心的问题。 沃特世公司深刻了解生物样品分析的需求、并在这方面一直处于业界领先地位，沃特世的生物分析系统解决方案可以帮助解决从样品前处理到液质联用分析方法开发的所有难题：Oasis® 固相萃取技术和OstroTM磷脂去除板带来最快、最便捷、最干净的样品前处理方法，ACQUITY UPLC® 带来最快速、最有效的分离效果和最高的灵敏度，Xevo® TQ-S将带来无可匹敌的灵敏度和您期望的多功能性。此次研讨会邀请到了来自沃特世公司美国总部的应用专家Jessalynn P. Wheaton作了&ldquo 基质效应对生物样品分析的挑战&rdquo 及&ldquo 如何建立系统的生物样品分析方法&rdquo 的报告，并且在实验室进行现场演示和分析，相信通过此次研讨会，与会专家们从前处理到方法开发都能找到适合自己的生物分析解决方案。 关于沃特世公司 (www.waters.com) 50多年来，沃特世公司(NYSE:WAT)通过提供实用和可持续的创新，使医疗服务、环境管理、食品安全和全球水质监测领域有了显著进步，从而为实验室相关机构创造了业务优势。 作为一系列分离科学、实验室信息管理、质谱分析和热分析技术的开创者，沃特世技术的重大突破和实验室解决方案为客户的成功创造了持久的平台。 2010年沃特世拥有16.4亿美元的收入和5,400名员工，它将继续带领全世界的客户探索科学并取得卓越成就。 ### 沃特世联系方式 Brian J. Murphy， 公司联系电话： +1 508-482-2614 brian_j_murphy@waters.com 联系人: 叶晓晨 电话:021-61562643 电子邮箱:xiao_chen_ye@waters.com