基金测序

无需进行文库制备，所用DNA样本比标准方法更少2012年12月13日 来源： 中国科技网 作者： 陈丹 中国科技网讯 据物理学家组织网12月12日（北京时间）报道，英国研究人员简化了基因组测序的标准流程，首次无需进行文库制备便完成了DNA（脱氧核糖核酸）单分子测序，而且新方法只要很少量的DNA就能获得序列数据，用量可低至不到1纳克（10亿分之一克），仅为常规测序方法的500分之一到600分之一。 文库制备是指从测序前基因组样本中提取不同长度的DNA片段，这一过程不仅费力、费时，还会浪费DNA，而新技术能极大地减少DNA的损耗，并缩短测序时间。 该研究论文的第一作者、英国威康信托基金会桑格研究所的保罗·库普兰说：“我们用这种方法对病毒和细菌的基因组测序后发现，即使在相对较低的水平，我们也能够确定所检测的是何种有机物，不论样本中是否存在特定的基因或质粒（这对于确定抗生素耐药性很重要），或者其他信息，如对特定DNA碱基的修改等。”他表示，一旦技术得到优化，将在快速、高效地识别医院和其他医疗场所中的细菌和病毒方面具有很大的应用潜力。 研究小组利用第三代单分子测序系统PacBio RS演示了这种简化的直接测序方法。他们仅仅用800皮克（千分之一纳克）DNA来分析一个生物体的基因组，尽管测序仪只读取了基因组的70个序列片段，相对于常规测序方法获得的数据来说不过是很小的一部分，但这些信息足以让研究人员确定他们所检测的生物体的品种。 这项技术也使得科学家能够对此前无法识别的宏基因组（也称微生物环境基因组）样本中的生物体进行确认。“为微生物测序，首先需要能够在实验室中培养它们。”论文的主要作者、英国巴布拉汉研究所的塔米尔·钱德拉说，“这不仅耗费时间，而且有时候微生物不生长，为它们的基因组测序极其困难。”他表示，新方法可以直接对微生物测序，短时间内便可确定其“身份”。 论文的另一主要作者、威康信托基金会桑格研究所的哈罗德·斯维尔德洛说：“我们的技术可以在对所测序列没有任何先验知识、没有特定微生物试剂的条件下，在很短的时间内操作，这是一种很有前途的替代手段，可应用于控制感染等临床需要。”（记者陈丹） 总编辑圈点 长久以来，基因测序等围绕基因科学所展开的研究，都被人们贴上了从本源上解开人体生命奥秘、彻底解除遗传疾病威胁等殷切的标签。多国为提高社会健康水平，都开展了解码国民DNA的活动，有些甚至覆盖全基因组。然而，面对由30亿个碱基对构成的人类基因组，精确测序注定将是一场浩大而又漫长的工程。如何能快速、准确地将海量DNA数据转化为有帮助的实用信息，已经成为该领域科学家们面临的重大挑战之一。因而我们说，英国科学家此番取得的突破，不管是从整个学科研究的方法论层面，还是从临床应用的角度，都提高了基因研究服务于人类的速度。 《科技日报》（2012-12-13 一版）

以下问题是我摘抄的，当时记在我的记录本上，所以没有记下名字，很是抱歉。但是我想拿出来这是对大家的一种共享，所以祈求大家原谅。Q:我将PCR产物纯化后送测，结果说是双模板，测序峰重叠，请问是模板不纯吗？A:应该指的是模板不纯。可能是割胶纯化时，范围偏大，非目的基因片断亦混入其中。该非目的片断的大小与目的片断也类似。如果片断长度大的话，可以先连一下克隆载体，这样测序应该没有问题。 测序峰重叠不知道你讲的时双峰类型的还是指比较杂乱的而且无序的重叠： 如果是双峰（TP）,有可能是标本来源是杂合子的缘故，如果是后者，原因很多，一般看打印出的测许结果大致可以判断。原因：1。有时候PCR产物可能就是失败的产物或者浓度很低。2．提纯不好，非目的片段保留。3．测序时Matrix等条件的错误。Q:测序结果不好，测序峰比较乱，基线不平，测许公司说含有复杂结构，现急需要该序列，请问高手这种情况该怎么办？有什么测许方法？A；我自己曾经亲自做过测序，对于这种情况，一般是有解决的方法的。不过公司不愿意为了你自己的一个样品去专门摸索条件。1． 最大可能是提取的质粒不纯，可以将质粒再次转化后挑单克隆重做（很奏效）。2． 直接在测序前的模板热变性使用86度，5分钟而不是大多数的96度3分钟3． 实在不行切后分别放到T载体上，一般都可以保证顺利读出序列。最后值得一提的是如果能自己根据理论序列给设计几个比较合理的测序引物可能一切就OK了。Q:上星期将我的PCR纯化产物拿到TAKARA测序，结果今天公司打电话来说测了100多个bp就读不下去了，建议我克隆后再测，我的PCR产物纯化只有很亮的一条带，不知道为什么测不出来。答：测不下去的原因主要是序列里面有困难序列，二级结构或短序列重复，比如发卡结构和AT长重复等，甲基化的影响不大清楚，本人认为不会影响测序。所以，PCR产物测不下去的话，克隆后也很难保证测过去。其实就测序来说，PCR产物还是质粒都无所谓，只要样品纯可以了。正向测不通反向再测也可能会测通，因为DNA中正链和反链二级结构不是完全一样的，正链中遇到困难序列在反链中可能相对简单，测序酶可能可以急需合成DNA。另外，还可以改一下测序PCR的反映条件等等，也可以测通。

各位大神： 最近有个朋友跟我提到了一个测序电泳槽，想问问各位大神什么事测序电泳槽啊？它的工作原理是怎么样的，电泳基本知识我知道，但测序电泳它是如何实现测序和微卫星分析等等功能的？