核酸分子

近日，湖南大学谭蔚泓院士团队与浙江大学医学院附属第一医院黄河教授团队开发了一种基于核酸适体的质谱流式技术，用于单细胞的细胞表面蛋白分析，旨在为疾病的精准分子分型提供一个新的平台技术。该方法不仅能够实现培养细胞的分子分型和分类，还能结合机器学习，实现临床样本亚型的分类。该方法极大地扩展了核酸适体的应用领域，并为疾病的分类和诊断提供了新方法。　　背景介绍：　　高度异质性是恶性肿瘤的重要特征，同一疾病的不同亚型可能对临床治疗有着完全不同的反应。因此，疾病的精准分子分型对其诊疗研究具有重要意义。虽然基因组测序和转录组测序已经成为最常用的分类策略，但它们无法提供蛋白质的表型和功能数据。单细胞水平的膜蛋白分析将为疾病分型提供重要信息。流式细胞术提供了高通量的单细胞测量技术。然而，由于荧光光谱重叠问题，限制了荧光流式细胞术的多元分析能力。质谱流式作为一种先进的替代方法，具有信号重叠小和细胞背景噪声低等优点，已展现出在一次实验中同步测量超过40个细胞参数的能力。尽管质谱流式技术在多路复用单细胞分析中的巨大潜力，但其在肿瘤分类中的潜力受到识别探针种类不足的限制。　　核酸适体作为一种新型的识别配体，具有特异性高、合成简单、免疫原性低、修饰方便等优势。此外，以完整的活细胞为筛选对象，可以通过Cell-SELEX（指数富集配体进化技术）获得大量能够特异性识别细胞膜蛋白标志物的核酸适体。　　本文亮点：　　基于以上研究背景，湖南大学谭蔚泓院士团队联合浙江大学医学院附属第一医院黄河教授团队设计、合成了一种由二乙烯三胺五乙酸（DTPA）基元组成的聚合物，用于螯合多个金属离子。然后，选择了一系列识别不同细胞表面生物标志物的核酸适体，每个适体分别与螯合了不同金属离子的聚合物偶联（Apt-MICP）。最后，评估了基于Apt-MICP的细胞表面蛋白分析在培养细胞和临床样本中用于血液恶性肿瘤（HM）精确分类的潜力（图1）。图1. 基于核酸适体的质谱流式分析技术用于血液恶性肿瘤的分子分型作者首先对聚合物进行了设计与合成，并通过点击化学将其与核酸适体相连（图2a）。利用琼脂糖凝胶电泳和高效液相色谱对产物进行表征，证明了sgc8c-MICP的成功合成（图2b，c）。同时，在核酸适体上修饰上荧光基团，利用荧光流式验证了sgc8c-MICP仍然能够靶向CEM细胞，而不会结合Ramos细胞（图2d，e）。图2. sgc8c-MICP的合成与表征　　在证明了该策略的有效性之后，作者挑选了15条相关的核酸适体，将其连接上螯合了不同金属离子的聚合物，得到15条Apt-MICP。将15条核酸适体联用，依次对8种血液恶性肿瘤细胞系进行结合，通过质谱流式进行分析。将得到的结果进行归一化，并用热图进行展示（图3a）。利用viSNE降维分析方法对分型结果进行分析，实现8种细胞的区分（图3b）。结合无监督的主成分分析方法，实现血液恶性肿瘤细胞系更精确的区分（图3c）。图3. 血液恶性肿瘤细胞系的细胞表面特征分析及分类　　利用上述合成的15条Apt-MICP，结合五种相关的抗体，实现了31例血液恶性肿瘤临床样本（包括AML、ALL、B淋巴瘤以及CML四种亚型）的分子分型（图4a）。由于临床样本的异质性高，作者利用机器学习的方法进行PLS-DA建模，并成功将四种亚型的样本区分开来（图4b），总体准确率达到了100%（图4c）。图4. 临床样本训练集的分子分型和分类　　为了进一步验证该模型的有效性，作者又收集了15例临床样本，得到了分子图谱（图5a）。将分型结果输入到模型当中，实现对每个样本亚型的判定，总体准确率达到了80%（图5b）。图5. 临床样本测试集的分子分型和分类　　总结与展望：　　综上所述，该研究开发了一个基于核酸适体的质谱流式检测平台，用于精确的癌症分类。作者合成了一系列核酸适体-金属标签探针，并证明了它们在细胞类型特异性结合以及质谱流式检测方面的良好性能。通过用15个核酸适体探针分析细胞表面特征，可以很好地区分8个HM细胞系。此外，通过结合机器学习（PLS-DA），对HM临床样本的四个亚型构建了一个高质量的分类模型，在训练集中分类总准确率为100%，在测试集中分类总准确率为80%。基于这些结果，基于核酸适体的质谱流式平台有望在其他疾病的分类和诊断中得到广泛应用。该工作以Research Article的形式发表在CCS Chemistry。

核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的一种崭新的分子生物学技术。它是基于 DNA分子碱基互补配对原理，用特异性的核酸探针与待测样品的DNA/RNA形成杂交分子的过程。分子杂交实验依据其形式的不同可以分为液相杂交、固相杂交、原位杂交，而固相杂交又可以分为菌落杂交、点/狭缝杂交、Southern印迹杂交和Northern印迹杂交。各类型杂交稻基本原理和步骤是基本相同的，只是选用的杂交原材料、点样方法有所不同。 　　核酸分子杂交的技术应用： 　　(1)Southern印记杂交 　　1、单基因遗传病的基因诊断：早在1978年，简悦威等医学家在镰状细胞贫血症的基因诊断中就采用过Southern杂交的方法，取得了基因诊断的突破。 　　2、基因点突变的检测：例如ATP敏感性钾离子通道的亚单位内向整流钾通道基因A635G突变的检测 　　(2)Northern印记杂交Northern印记技术多用来检查基因组中某个特定的基因是否得到转录以及转录的相对水平。 　　目前，Northern印记技术仍然被认为是检测基因表达水平的金标准。(3)液相杂交 以液相杂交技术为基本工作原理设计的多功能悬浮点阵仪是液态芯片技术应用的典范。这一技术平台已被应用于遗传突变的分子诊断，如出生缺陷干预工程中的Down&rsquo s综合征、珠蛋白合成障碍性贫血、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷的基因诊断，也已被用于SNPs分析、感染性疾病的鉴别诊断、药物敏感性和亲子鉴定。此外，还可以应用于基因表达谱的分析，从而进行肿瘤性疾病如血液病、乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、膀胱癌和结肠癌的分子病理学研究。 　　比朗小编总结到尽管核酸分子杂交技术的应用越来越广泛，但其在临床实用中仍存在不少问题，必须提高检测单拷贝基因的敏感性，用非放射性物质代替放射性同位素标记探针以及简化实验操作和缩短杂交时间，这样，就需要在以下三方面着手研究： 　　第一，完善非放射性标记探针 　　第二，靶序列和探针的扩增以及信号的放大 　　第三，发展简单的杂交方式，只有这样，才能使DNA探针实验做到简便、快速、低廉和安全。 　　上海比朗仪器有限公司专业生产分子杂交仪、分子杂交箱、紫外交联仪厂家，了解分子杂交技术更多信息请链接：http://www.canytec.info

引言新冠病毒肺炎疫情的爆发，推动了国内分子诊断技术的高速发展，同时也使得“核酸”成为大家耳熟能详的词汇。当前的核酸分析技术，主要是基于荧光定量PCR（qPCR）的原理，虽然具有灵敏、准确、便捷的优势，但却通常只能对少于5个的靶标进行分析。不过这样相对有限的检测靶标数目，虽然在新冠检测等特定应用场景已经足够有效（即判断是否感染新冠），却难以应对一些复杂疾病的检测，如肿瘤、出生遗传缺陷、精-准用药的检测等。因为这些疾病通常都涉及到更多的基因变异情况，需要有具备更广泛的检测能力的技术。而核酸质谱技术，就是一个非常好的进行多重核酸分析的分子诊断平台。核酸质谱原理说到质谱的技术，领域内的人应该并不是完全陌生。顾名思义，质谱就是对“质量”进行精-确检测的精密设备，也是临床诊断领域快速发展的未来平台之一。质谱可以用来检测蛋白质和代谢物，也可以用来检测核酸。生命的遗传物质DNA分子是由4种碱基——ATCG所构成的，每种碱基的分子质量不同。核酸质谱犹如一把高精度的天平，可区分单个碱基的质量差异(GATC)（图1）。当核酸发生变异的时候，不论是碱基的替换还是修饰，都会改变DNA的分子质量，核酸质谱通过对这种质量变化的精确分析，就能够对其进行精-准的识别。通过这种方式，核酸质谱既可以检测基因的多态性和基因的突变，也可以检测核酸的化学修饰，还能够对拷贝数变异和修饰水平等进行定量的分析。图1 DNA分子碱基组成核酸质谱的优势相比传统的qPCR等分子诊断手段，核酸质谱拥有多重、准确、高通量的优势。这是由核酸质谱的检测原理和技术路线所决定的。首先，核酸质谱直接依据分子量的差异来进行检测，只要待测靶标扩增后的分子量不同，就可以相互区别开来，不会像传统的qPCR一样受到荧光通道数的限制。因此，50重乃至更多靶标的分析，