发酵工业

本文引用自laoding《发酵工业污染的防止与挽救》南山人编著 第一节 工业发酵染菌的危害 发酵工业自从采用纯种培养以后，产率有很大提高，然而，防止染菌的要求也更高了。人们在与杂菌污染的斗争中，积累、总结了很多宝贵的经验。为了防止染菌，使用了一系列的设备、工艺和管理措施。例如：密闭式发酵罐，无菌空气制备，设备、管道和无菌室的设计，培养基和设备灭菌，培养过程及其他方面的无菌操作等，大大降低了染菌率。但是至今一些现代发酵工业还遭受染菌的严重威胁，甚至由于染菌而造成巨大的经济损失。据报道, 国外抗生素发酵染菌率为2％～5％，国内的抗生素发酵、青霉素发酵染菌率2％，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率约为5％，谷氨酸发酵噬菌体感染率1～2％。染菌仍是发酵工业的致命伤。轻者影响产率、产物提取收得率和产品质量；严重者造成“倒罐”，浪费大量原材料，造成严重经济损失，而且扰乱生产秩序，破坏生产计划。遇到连续染菌，特别是又找不到染菌原因，未有防治措施时，往往会影响人们的情绪和生产积极性，造成无法估量的危害。 染菌对发酵产率、提取收得率、产品质量和三废治理等都有很大影响。然而，生产不同品种，污染不同种类和性质的杂菌，不同的污染时间，不同的污染途径、污染程度，不同培养基和培养条件，所产生后果是不同的。1、染菌对不同品种发酵的影响 由于各种发酵的菌种、培养基、发酵条件、发酵周期以及产物性质等不同，受污染的危害程度也不同。青霉素发酵，由于许多杂菌都能产生青霉素酶，当青霉素发酵无论是在前期、中期或后期感染都能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏，使发酵一无所获。疫苗深层培养，一旦受污染，无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都应全部废弃。柠檬酸发酵，在产酸后，pH值很低，一般杂菌不易生长，柠檬酸主要防止前期染菌。谷氨酸发酵周期短，生产菌繁殖快，培养基不太丰富，一般较少污染杂菌，但噬菌体污染对谷氨酸发酵的威胁非常大。肌苷、肌苷酸发酵，由于生产菌是多种营养缺陷型，生长能力差，培养基营养丰富等，容易受杂菌污染，且杂菌污染后，营养成分迅速被消耗，严重抑制生产菌生长和代谢产物的生成。然而，无论哪种发酵，染菌后都由于糖等基质被消耗，影响发酵产物的生成，使产量大为降低。 2、感染不同种类和性质的杂菌对发酵的影响 抗生素发酵中，青霉素发酵污染细短产气杆菌比污染粗大杆菌危害更大，链霉素发酵污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比污染粗大杆菌更危害，四环素发酵最怕污染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌。柠檬酸发酵最怕污染青霉菌。肌苷、肌苷酸发酵最怕污染芽孢杆菌。谷氨酸发酵最危险的是污染噬菌体，因为噬菌体蔓延迅速，难以防治，容易造成连续污染。 3、不同污染时间对发酵的影响 （1）种子培养期染菌 （2）发酵前期染菌 （3）发酵中期染菌 （4）发酵后期染菌 (1)种子培养期染菌种子培养主要是生长繁殖菌体，菌体浓度低，培养基营养丰富，比较容易染菌。种子培养期染菌，带进发酵罐中危害极大，应严格控制种子污染。当发现种子受污染均应灭菌后弃去，并对种子罐、管道进行检查和彻底灭菌。 (2)发酵前期染菌 发酵前期主要是菌体生长繁殖，代谢产物生成很少，这个时期容易染菌，污染后杂菌迅速繁殖，与生产菌争夺营养成分和氧分，严重干扰生产菌的生长繁殖和产物的生成，要特别防止发酵前期染菌。当发酵前期染菌时，由于营养成分消耗不多，应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分(如果体积太大，可放出部分受污染发酵液）重新接种进行发酵。(3)发酵中期染菌发酵中期染菌将严重干扰生产菌的代谢，影响产物的生成。有的杂菌繁殖后产生酸性物质，pH值下降，糖、氮消耗迅速，菌(丝)体自溶，发酵液发粘，产生大量泡沫，代谢产物的积累迅速减少或停止，有的已生成的产物也会被利用破坏，有的发酵液发臭。由于发酵中期染菌，营养成分大量消耗，一般挽救处理困难，危害性很大。所以，发酵中期染菌应尽力做到早发现，快处理。处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定。如：抗生素发酵，可将另一罐发酵正常、单位高的发酵液的一部分输入染菌罐中，以抑制杂菌繁殖，同时采取低通风，少流加糖；柠檬酸发酵中期染菌，可根据所染杂菌的性质分别处理，如污染细菌，可加大通风量，加速产酸，降低pH值，以抑制细菌生长，必要时可加入盐酸调节pH3.0以下，抑制杂菌；如污染酵母，可加入O.025～O.035 g／L硫酸铜，抑制酵母生长，并提高风量，加速产酸；如污染黄曲霉，可加入另一罐将近发酵成熟的醪液，使pH值下降,使黄曲霉自溶；但污染青霉则危害很大，因为青霉在pH值很低下能够生长，如果残糖较低，可以提高风量，促使产酸和耗糖，提前放罐。 (4)发酵后期染菌发酵后期产物积累较多，糖等营养物质接近耗尽。如果染菌量不太多，可继续进行发酵；如污染严重，破坏性较大，可以采取措施提前放罐。发酵后期染菌对不同产物的影响不同，如抗生素、柠檬酸发酵后期染菌影响不大，而肌苷、肌苷酸和谷氨酸、赖氨酸等发酵后期染菌会影响产物的产量、产物提取和产品质量。 在染菌严重时，有人主张加入不影响生产菌正常代谢的某些抗生素、呋喃鲁西林、对苯二酚、新洁尔灭等灭菌剂、抑制杂菌生长。例如：庆大霉素发酵染菌，可加入少量庆大霉素粉或对苯二酸；灰黄霉素发酵染菌时，可加入新霉素。但是，在发酵开始时都加入杀菌剂以防止染菌，似无必要，也增加成本，若当发酵染菌后再加入杀菌剂又为时已晚，实际效果值得探讨。 4、染菌程度对发酵的影响染菌程度愈太，即进入发酵罐的杂菌数量多，对发酵的危害愈大。当生产菌已迅速繁殖，在发酵液中占有优势，污染极少数杂菌，如每1L中有1～2个杂菌，对发酵不会带来影响，因为这些杂菌需要时间繁殖才能达到危害发酵的程度，而且环境对杂菌的繁殖已不利。当75m3发酵液污染1个杂菌，要达到大幅度(106个／mL)污染时需要的时间(h)为： 条件 污染10000000个／mL 污染100000000个／mL 增代时间tg=30 min 23 26 延迟6h tg=30min 29 32 增代时间tg=2h 92 10000000 延迟6h tg=2h 98 11*11但是污染幅度较大时，特别是发酵前期和中期污染，将造成严重的危害。5、染菌对产物提取和产品质量的影响对于丝状菌发酵被污染后，有大量菌丝自溶，发酵液发粘，有的甚至发臭。发酵液过滤困难，发酵前期染菌过滤更困难，严重影响产物提取收率和产品质量。在这种情况下可先将发酵液加热处理，再加助滤剂或者先加絮凝剂，使蛋白质凝聚，有利于过滤。染菌的发酵液含有较多蛋白质和其他杂质：（1）如果采用沉淀法提取产物，那么，这些杂质随产物沉淀而影响下工序处理，影响产品质量。如谷氨酸发酵染菌后，在等电点出现β-型结晶，使谷氨酸无法分离，β-结晶谷氨酸含有大量发酵液，影响下工序精制处理，影响产品质量。（2）如果采用溶媒萃取的提取工艺，由于蛋白质等杂质多，极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，也影响进一步提纯。（3）如果采用离子交换法提取工艺，由于发酵液发粘，大量菌体等胶体物质粘附在树脂表面或被树脂吸附，使树脂吸附能力大大降低，有的难被水洗掉，在洗脱时与产物一起被洗脱，混在产物中，影响产物的提纯。 此外，发酵染菌也造成三废处理困难和对环境的污染。 第二节 染菌的检查、原因分析和防止措施 1、染菌的检查与判断

传统的酿造工业和近代发酵工业多为劳动密集型产业，自动化程度较低。近些年来随着连续发酵技术、现代生物分离技术、生物反应器技术、生物传感器技术等现代生物工程技术快速发展．基因工程生物新产品不断出现，加快了发酵工业向技术密集型转变的进程。而影响这一进程的关键因素之一就是发酵过程最优化控制技术，特别是发酵过程连续在线监测控制技术。发酵过程是一个非性线、多变量和随机性的动态过程，发酵体系是一个复杂的被控对象。温度、溶氧、pH、培养基成分、细胞形态、细胞浓度、产物组成及含量等均是发酵过程的重要控制参数。以往测定这些参数采用离线分析，不能及时反映发酵过程的状态，无法实现自动控制和连续跟踪。因此，工业发酵过程中最优化控制技术主要是在线测控系统。在线测控系统可连续、迅速、准确实现取样、检测、信号处理、反馈控制等过程，实现工业发酵过程最优化的自动控制。随着计算机及控制技术的突飞猛进，生物传感器技术的发展，发酵动力学模型研究的完善，发酵过程控制系统愈来愈多，应用范围亦越来越广。但是，工业上实现发酵过程最优化自动控制的实例却不多，仍以人工控制和半自动控制为主。1 工业发酵过程最优化控制的现状与难点总的来看，目前发酵工厂发酵过程的计算机应用和自动化控制程度不高，落后于其他领域。现代化的发酵工厂已初步实现对部分因素如温度、溶氧、pH、搅拌转速、流速等的在线检测，也可对其变化进行单因素控制，但仍与发酵最优化的自动控制目标相去甚远，即难以成功建立对培养系统进行系统的反馈性控制。其发展滞后的主要原因如下：1．1 微生物生长代谢的特殊性 这是由于发酵过程的微生物学属性，使得其不同于一般的化学反应系统，其特殊性表现在：1)微生物细胞的生长繁殖、产物的代谢既随外界条件的变化而变化，亦随遗传基因的变异而变化；2)微生物细胞是有生命的，必然要经历幼龄、壮龄、衰老和死亡等过程，发酵过程微生物之间是不同步的，微生物个体之间是有差异的；3)相当一部分发酵过程的生物化学反应途径尚不清楚，难以对反应变化进行精确的计算。因此，目前的发酵动力学模型多为经验或半经验模型，或为简化的模型；4)人类对生命科学的认知程度很低，即使对最简单的生物一微生物的认知程度也不充分，对发酵机理的认识还远远不够，对许多发酵产物形成的代谢调控机制还没有完全研究清楚，难以确立最佳的控制条件和手段；5)细胞的生长和目的代谢产物的形成最优控制条件往往是不一致的。1．2 发酵生产过程控制的复杂性 影响发酵生产过程的因素较多，远比一般化工生产过程复杂，对生产过程控制的难度较大，具体体现在以下几个方面：1)发酵过程是生化反应与化学物质跨膜(细胞膜)传输过程的叠加，属于气、液、固三相反应系统；2)由于菌体(尤其是菌丝体)的数量变化和各种代谢产物的不断积累，发酵过程发酵液粘度变化复杂，多呈非牛顿型流体性质，给传质、传热的控制带来困难；3)影响生化反应的因素除物理因素和化学因素外，还有生物因素，如细胞之间的影响、杂菌的干扰等；且这些因素又互相关联，给反应过程控制带来困难。无菌操作对生产设备和工艺都有特殊的要求；4)发酵原料多属生物材料，一般使用天然或半天然培养基，培养基成分复杂。因此，实际生产中只能对主要成分进行检控；5)生物反应器不同于一般的化学反应器，要人工提供微生物生长代谢的最佳物理、化学和生态的环境。要在生物反应器内保持菌种的最佳状态，减少各种营养物、代谢物对细胞生长和代谢的阻遏效应等均较困难；6)供在线检测用的传感器的种类和质量还远不能满足发酵最优化控制的要求。2 工业发酵过程最优化控制对策目前的最优化控制条件大多建立在经验的基础上，要取得发酵过程最优控制的突破，首先需要具体发酵产品的微生物生长代谢，发酵调控原理认识的突破，并在此基础上运用科学的方法建立发酵过程数学模型，为计算机的应用提供条件。其次，建立和完善硬件技术，即发酵过程各种参数在线检测控制的设备技术。2．1 发展完善发酵过程在线测控技术 发酵过程在线测控装置一般包括三个部分：分析检测装置(传感器)、将检测装置与发酵介质相结合的取样过滤装置、实现控制理论的反馈和控制装置，即信号传输装置和计算机。目前正在应用和研究的在线测控装置有以下几种。2．1．1传感器系统 一种直插式传感器，为直接安装在反应器内实现在线监控的传感器。已用于发酵生产中的主要是罐内物化参数的测定，如温度、溶氧、pH、转速、罐压、粘度、浊度及流量等。此类传感器的性能较稳定，应用也较为普遍，在氨基酸发酵、啤酒发酵等生产中均有应用，实现了部分参数的在线监控。其主要特点是能够承受高温高压环境，常用的有热电偶传感器、转速传感器、测力传感器、玻璃传感器、光学传感器及溶氧传感器等。另外，微生物传感器可用于测量发酵工业中的原材料（如糖蜜、乙酸等）和代谢产物（如谷氨酸、乳酸等）测量装置基本上都是由适合的微生物电极与氧电极组成原理是利用微生物的同化作用耗氧通过测量氧电极电流的变化量来测量氧气的减少量从而达到测量底物浓度的目的。在测定微生物细胞数量时，在阳极Pt表面上菌体可以直接被氧化并产生电流，这种电化学系统可以应用于细胞数目的测定。测定结果与常规的细胞计数法测定的数值相近，利用这种电化学微生物细胞数传感器可以实现菌体浓度连续、在线测定。2．1．2 流动注射检测系统(FIA) 有些传感器不能承受高温高压环境或不适合微生物发酵环境，因此不能作为直插式传感器直接在发酵罐内使用，如生物传感器。流动注射检测系统(FIA)可较好地解决这一问题，FIA 系统由取样装置、样品预处理装置、泵、注射选择阀、传感器、信号转移和数据处理计算机等组成。生物传感器安装于反应器外，样品被处理后送至反应器外与生物传感器接触反应产生信号，实现发酵过程的在线测控。常用于FIA系统的生物传感器有电流式电极、pH 电极、Bio—FEF电极、光学生物传感器、光纤生物传感器以及化学发光传感器等。2．1．3 映象在线控制系统 随着光学技术的不断发展，直接将光学显微镜安装在反应器内，在线监测发酵过程中细胞的形态和生理状态，并可以对细胞数量、大小、种类进行计算统计，荧光显微镜还可以监测细胞代谢过程。将映象在线控制系统与流动注射检测系统结合，可成为更有效的监测系统。一个典型例子是用于在线监测细胞培养状态的FI—FCM系统。该系统样品首先从生物反应器传人多位置的真空管并同时排空，数十种不同的样品和反应剂被筛选，通过连接着十条真空管的精密注射泵导人系统，连接着双向真空管的微室用于稀释样品或将样品与不同的反应剂混合。然后将处理后的样品通过自由脉冲方式注人流动细胞测定仪，流动细胞测定仪可测定培养过程中细胞大小和数量、通过观察荧光变化检测绿色荧光蛋白形成的动力学过程等，流动细胞测定仪的数据处理由主机完成，连接有系统控制板和数据控制板的计算机对系统进行控制。

【作者】： ,吕旭聪 黄志清 黄若兰 黄彬红 饶平凡 倪莉 【题名】： 反相高效液相色谱法同时快速测定黄酒和葡萄酒中有机酸的含量【期刊】：《食品与发酵工业》,【年、卷、期、起止页码】：《食品与发酵工业》 2010年06期