样品制备技术

岩相样品切片、减薄的制备技术交流之二——岩相样品制备SOP 一、岩相样品的粘结 ● 用MetLab的中型METCUT-10或大型METCUT-12A，甚至20A的砂轮切割机，将大尺寸的岩相样品统一切割至适合载玻片的长、宽、厚度。 ● 或者，用MetLab的岩相精密切割&研磨一体机METCUT-10GEO，将真空卡盘换装机械夹具（工作台的T型槽是8mm，所以夹具的T型一定要配8mm的），固定好岩相样品后，摇动切割手轮，沿Y轴（纵向）进行切割，切割出想要的薄片。 ● 在合适材质（如，氧化铝，碳化硅，金刚石等）的平面研磨磨石、或磨盘、或薄膜、或砂纸上，将切好的岩相样品的非研究面预磨出一个哑光表面，以此创建一个与载玻片粘合的表面。 ● 在工作台上铺一张油脂薄膜或纸。取出载玻片。如果同时制备多个样品，则将长、宽、厚度相同的载玻片排列开来。载玻片的尺寸较多，常用尺寸为27x46mm，这个尺寸是和岩相精密切割&研磨一体机的真空卡盘尺寸相匹配的。 ● 建议使用QMAXIS（可脉）的环氧树脂和固化剂作为粘结剂——其中，无孔隙的岩相样品，用EpoQuick系列；而有孔隙样品，则选用EpoFlow系列——按标签提示的比例混合，倒入混合蜡纸杯中，用搅拌棒缓慢地搅拌约2分钟。 ● 首例描述无孔隙的岩相样品。将混合好的EpoQuick环氧树脂和固化剂均匀地涂抹在岩相样品的非研究面，反过来放在载玻片上，轻轻地前后移动压挤，去除所有气泡。用搅拌棒刮掉载玻片上挤压出的环氧树脂。 ● 将粘结好的岩相样品放在薄片样品粘结台METBOND GEO上，利用压簧压实后静置约2小时。METBOND GEO是带加热板的薄片样品粘结台，为了加快树脂固化的速度，可以打开加热开关，在控制面板上设定温度即可。如果没有配置MetLab的METBOND GEO——也就是没有加热板的薄片粘结台——可以将薄片样品粘结台放置在60°C左右的热板上加热，或者在室温条件下自然固化。 ● 当然，粘结剂也可以选用QMAXIS（可脉）的Mounting Adhesive热熔胶。将载玻片和岩相样品（非研究面朝上）放在加热台上，加热到100-120℃时，用热熔胶棒均匀地涂抹岩相样品的非研究面和载玻片，观察热熔胶完全熔化后，将岩相样品的非研究面粘到载玻片上，移至薄片样品粘结台，压实后静置至完全冷却。 ● 注意，薄片粘结台是选配件，需要单独购买。它不仅可以压实样品，而且可以精确地控制样品与载玻片之间粘结剂的厚度，这为消除样品和载玻片的公差，使多片样品制备一致提供了基础。 ● 第二例描述的是更普遍存在的多孔隙的岩相样品，这时必须调整粘结技术。选择合适尺寸的橡胶注模杯，将岩相样品研究面朝下放入橡胶注模杯中，将EpoFlow环氧树脂和固化剂按标签所示比例倒入混合蜡纸杯中，用搅拌棒缓慢搅拌约2分钟后，把蜡纸杯放入QMAXIS（可脉）的Air-Out真空系统，抽真空——放气——抽真空，循环操作3-4次。最后一次放气后，打开Air-Out穹顶盖，将蜡纸杯中的混合液倒入橡胶注模杯中。再把橡胶注模杯放入Air-Out腔体内，同样地抽真空——放气——抽真空，循环操作3-4次，最后一次抽完真空后，关闭真空泵，保持真空静置8-10小时。上述两轮操作，使树脂液和样品中的空气被彻底排除。树脂液浸渗至岩相样品的孔隙中，支撑样品结构，使下一步切片和研磨减薄操作不会损伤样品的结构。 ● 当环氧树脂完全固化后，从橡胶注模杯中取出镶嵌块，对镶嵌块的非研究面进行研磨找平。然后按EpoQuick的同样步骤，将镶嵌块的非研究面粘到载玻片上。 ● 如果镶嵌块的长、宽、厚度超出载玻片，可以对镶嵌块进行切割、研磨整理。 二、岩相样品的切片 MetLab的岩相精密切割&研磨一体机METCUT-10GEO的切割和研磨分列于设备的两侧，一个电机，两侧同轴，保持切割、研磨的平行性高度一致。 ● 未开机前，先安装金刚石切割片。将METCUT-10GEO左侧切割室的透明防护罩向上开启——这种开启方式的设计节省了空间，方便使用者进行操作。取出10in（254mm）的金刚石切割片，其轴心孔径1.25in（31.75mm）。用随机工具卸下切割侧主轴上的法兰，按切割片顺时针的旋转方向（QMAXIS的Logo朝外即可），套入切割片。扣上法兰，锁紧螺母。 ● 打开METCUT-10GEO主开关。触摸屏首页出现MetLab的Logo时，触摸屏幕任意位置，进入操作主菜单页面。 ● 装上样品。点击主菜单上切割侧的真空开关（2），将粘结好岩相样品的载玻片的一面贴到真空卡盘表面，真空卡盘吸住载玻片。小尺寸的真空卡盘，有三个突出螺钉辅助将较小尺寸的载玻片进行位置确认。 ● 定位切割位置。切割侧的真空卡盘安装在工作台上的卡盘座上，利用测微计旋钮驱动工作台沿X轴（横向）左右移动。测微计旋钮一个刻度是0.005mm，旋转一圈移动1mm。X轴总行程是20mm，满足任何薄片样品的厚度调节。通过测微计旋钮，使样品与切割片保持正确的左右距离，即找准想要的切割位置。 ● 关闭切割室防护罩。防护罩的磁性安全开关锁闭防护罩。 ● 在触摸屏控制面板设置切割片转速（4）。转速100-3000rpm/min，增量1rpm/min。既可以点击箭头调升、调降，也可以用数字键盘输入转数值。点击切割侧的冷却水开关（5），冷却水流出，按下切割/研磨开关键（1），电机驱动金刚石切割片旋转。 ● 手动控制切割。匀速地顺时针摇动切割手轮，整个工作台沿Y轴（纵向）方向逐渐靠近切割片，开始切割。Y轴的总行程224mm，满足所有标准载玻片尺寸的长度方向通过。手动控制的优势是使用者操控的自由度大，不同材料、不同制备要求的薄片切割都可以自主调节。 ● 样品切割的保留厚度最薄约0.5mm。 ● 切割完成后，再次点击切割/研磨开关（1）、切割侧冷却水开关（5），切割电机停止旋转，冷却水关闭。逆时针摇动手轮，将样品离开金刚石切割片。 ● 开启切割室仓门，点击切割侧的真空开关（2），真空泵被关闭，从真空卡盘处取下载玻片，并从切割室工作台上取出被切割掉的样品。 ● 用水清洗载玻片及样品，准备研磨。 三、岩相样品的研磨 ● 同样地，开机前先安装金刚石杯形砂轮。金刚石杯形砂轮直径10in（250mm），轴心孔径1.25in（31.75mm）。标准配置的金刚石杯形砂轮是70μm的和30μm的。通常由粗到细研磨，先安装去除量较大的70μm的。将METCUT-10GEO右侧研磨室的防护罩向上开启。用随机工具卸下主轴的法兰，套入金刚石杯形砂轮（金刚石研磨面朝外），重新扣上法兰，锁紧螺母。 ● 打开METCUT-10GEO的主开关。同样地，触摸Logo页面的任意位置进入操作主菜单页面。 ● 装上样品。研磨侧的真空卡盘固定在研磨操作手柄同轴的研磨臂上。研磨手柄在研磨室的外面，研磨臂在研磨室内。点击研磨侧真空开关（3），将已经切割好的样品载玻片的一面贴到研磨侧真空卡盘表面。真空卡盘吸附住载玻片。 ● 定位研磨起始位置。调整研磨操作手柄的位置，使样品与金刚石杯形砂轮的金刚石表面相对应。逆时针旋转研磨手柄末端的测微计（数字千分尺），当样品表面接触到金刚石杯形砂轮的表面时，按下千分尺的清零键。向后拉下研磨操作手柄，使样品离开金刚石砂轮的表面。 ● 关闭研磨室防护罩。该防护罩也有磁性安全开关装置，锁闭防护罩。 ● 在触摸屏面板设置金刚石杯形砂轮的转速（4）。转速的设定同切割侧。点击研磨侧冷却水开关（6），冷却水流出。点击切割/研磨开关键（1），电机驱动金刚石杯形砂轮旋转。 ● 握住研磨操作手柄前后韵律地移动，使样品的表面均匀地摩擦旋转的金刚石杯形砂轮，随着样品被磨削减薄，用手逆时针旋转千分尺，使样品持续贴近金刚石杯形砂轮。在千分尺数显200μm之前，千分尺的每次进给10-20μm即可；在千分尺数显200μm后，进给调整为5-10μm，直至千分尺数显为70μm。 ● 当达到70μm厚度时（扣除粘结的树脂厚度，样品实际厚度约60μm），停止手柄的研磨操作。点击切割/研磨开关（1）、研磨侧冷却水开关（6），金刚石杯形砂轮停止旋转，研磨侧冷水停止流出。将研磨手柄向身体侧拉，是样品离开金刚石杯形砂轮。 ● 打开研磨室防护罩，点击研磨侧真空开关（3），关闭真空泵，取下样品。 ● 从上述第一步开始，重复实施30μm的金刚石杯形砂轮研磨减薄动作。有时，观察需要更好的表面性，则停止了70μm的研磨后，转至磨抛机进行研磨、抛光。 ● 样品研磨减薄的保留厚度取决于研究目的，最薄约0.03mm。

透射电镜样品制备技术之生物样品制备流程透射电镜常用的50-100 kV电子束来说，样品的厚度控制在10～100 nm为宜。由于电镜产生的电子束穿透能力很弱，需要把标本切成厚度小于0.1 µ m以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片(Ultrathin sectioning)。常用的超薄切片厚度是50-70 nm，也可进行冷冻超薄切片。超薄切片技术是为透射电子显微镜观察提供薄样品的专门技术，研究材料类、生物类样品的基本技术，尤其是观察细胞、组织、器官等的超微结构以及亚细胞结构常用的技术。也是电镜细胞化学、免疫电镜等技术的关键性技术。它在生物学的发展过程中占据重要的地位，目前各种细胞、组织的超微结构知识几乎都是由它提供的。冷冻超薄切片机 Leica EM UC7制备流程取材→固定→脱水→包埋（渗透、包埋、聚合）→超薄切片→电子染色（生物类）取材→清洗→包埋（渗透、包埋、聚合）→超薄切片→电子染色（材料类）生物样品超薄切片要求：（1）细胞的细微结构保存良好，没有明显的物质凝聚、丢失、添加等人工效应；（2）切片厚度50-100 nm为宜：太薄反差低；太厚反差好，但结构重叠，电子束不能穿透；（3）切片应耐电子束的强烈照射，不变形不升华；（4）切片能够适当被染色，保证一定的反差；（5）切片均匀，无皱褶、刀痕，无染色剂或其他化学物质的沉淀。取材目地和要求（1）新鲜。(材料离体后1-5 min内进入固定液，避免细胞自溶和结构变化)（2）体积小。(厚度（3）机械损伤小。(动作轻巧，器械锋利，避免对组织的挤压和推拉，建议用剃须刀片、手术刀片、手术剪刀。)（4）低温操作，器械、容器、固定液均需预冷（降低酶的活性，减少组织自溶）。（5）取材部位准确，且注意材料的方向性和定位。固定目的和要求：终止组织细胞的生化过程同时把它们的超微结构改变控制在最小范围内，并保护这些结构在后续的脱水、包埋等过程中不被破坏；将蛋白、离子等内容物保留在原位，以便后续的研究。固定液：固定剂＋缓冲液（1）破坏细胞的酶活性系统（2）稳定细胞物质成分，并保存之（3）接近细胞生活状态的渗透压,使细胞不收缩或膨胀（4）在组分的分子之间建立交联，提供骨架稳定细胞器的空间构型（5）提供一定的电子反差固定剂：戊二醛（C5H8O2)：渗透性好，保存蛋白质、酶活性，稳定糖元，无电子染色作用，固定脂类和膜差。可长时固定（低温可达半年）。锇酸（OsO4)：强氧化剂，固定脂类、膜结构，有电子染色作用；破坏酶活性。多聚甲醛：优良地保存酶活性，用于细胞化学。缓冲液：仿效细胞外液成分，对细胞富有生理保护。维持稳定的pH值；提供适当的渗透压；提供适当的离子成分使样品不抽提，不沉淀。固定方法：常用双固定法，用戊二醛对样品前固定，漂洗后使用锇酸对样品进行后固定。影响因素： 1.pH值：动物组织7.2-7.4，植物6.8-7.0，高度含水组织8.0-8.4 2.缓冲液类型：磷酸缓冲液、二甲砷酸盐缓冲液等，0.05-0.1 mol/L 3.渗透压：KCl, NaCl, 蔗糖调节 4.固定剂浓度：戊二醛2-6%，四氧化锇1-2% 5.材料大小：0.5-1 mm³ 操作步骤：戊二醛固定液：有细胞壁的样品5%，无细胞壁样品3%。加入缓冲体系，确保生物样本内外渗透压，避免细胞萎缩或吸涨。切取一小块组织，置入预冷的戊二醛固定液（3-5%）中，4℃预固定20分钟后，捞出置于洁净的保鲜膜或培养皿上（已滴有预冷的固定液），在固定液中用将组织切成2-5 mm长， 2-3 mm宽， 1 mm厚的细条，移入盛有预冷的戊二醛固定液的离心管中，4 ℃固定过夜。1.植物细胞的细胞壁和液泡会阻碍固定液迅速渗入。植物材料内部存有的空气，往往使材料漂浮于固定液面之上，由此影响到植物组织的固定效果。组织放入戊二醛固定液后，可用真空泵抽出组织内部的气体，使材料沉入固定液中。2.动物样本的取材，可将动物麻醉或急性处死后切取组织。或者采用原位固定、流灌固定后再切取所需组织。3.细胞培养的样品，轻微并短暂离心，倒净培养液后，加入预冷的固定液，4℃固定10 min后，低温6000 rpm/min离心5 min（离心力不可过大，离心时间不可过长，避免机械挤压），去上清，滴加新鲜固定液并重悬，4℃固定过夜。脱水用适当的有机溶剂取代组织和细胞中的游离态水分，使之能与包埋剂混合。要求：脱水要彻底；更换液体动作要迅速；脱水时间不宜过长；固定后的样品要充分漂洗。脱水剂：乙醇、丙酮、环氧丙烷等。步骤：逐级梯度脱水30％→50％→70％→80％→90％→95％(以上步骤每次15-20 min)→100％(2-3次，每次15 min)→100％丙酮(20 min) 包埋1.渗透：用包埋剂或混合液逐渐取代组织内的脱水剂（或前介质），使细胞内外所有的空隙被渗透液填充，使包埋剂逐步渗透到组织细胞内部,以便与细胞外的包埋剂同时聚合。包埋剂：聚合有良好的切割性能，软硬度易调节粘度低，易渗透；溶于脱水剂；电子透明度好，并具有一定的反差，聚合要充分、均匀，聚合温度要尽可能低；本身无结构，热稳定性好，可耐电子束轰击；来源丰富，且各批号性能尽可能一致；切片易染色,且对人体无害。常用Epon 812、Spurr、LR white等步骤：逐级梯度渗透，脱水剂:包埋剂3:1 → 1:1 → 1:3 →纯包埋剂2.包埋：将渗透好的样品块放入到适当的包埋模具中，灌装上纯包埋剂包埋。3.聚合：加温聚合形成固体基质，牢固地支撑整个细胞结构或组织，制成适于机械切割的固体包埋块，利于切片。步骤：37℃(12 h)→45 ℃(12-48 h)→60 ℃(24-48 h)超薄切片制刀：常用玻璃刀、钻石刀。刀上要装水槽，并注入槽液。槽液要求：不与材料发生化学反应，干净无杂质；液面与刀口基本平行；低粘度,蒸发量小；有一定的表面张力,有利于漂浮切片。常用的槽液：双蒸水、二甲基亚砜（DMSO）、甘油水溶液等。修块：除去组织周围多余的包埋介质和不感兴趣的部分，以提供较大的有效观察面积。并修成一定形状、大小的包埋块截面，便于连续切片。可手工、机械修块。切片：装块→装刀→对刀→加水→切片→捞片注意事项：对刀是关键；槽液用新鲜溶液；温度20~25℃，相对湿度60%；室内无空气流动，清洁，防止震动；刀槽密封，否则漏水。电子染色利用高密度的重金属染色剂（铅、铀）与细胞某些微细结构或成分结合，以增加样品局部的电子散射能力，提高电镜图像反差的方法。染色实质上是增大电子密度，电镜图像灰度不同。电子显微镜图片均为黑白灰，无彩色。常用染色剂：醋酸铀：主要染核酸、核蛋白、细胞核、结缔组织。要避光，有微弱的放射性柠檬酸铅：主要染膜结构、脂类、核酸。易与CO2反应成沉淀，染色中应避免。步骤：单染：铅盐单染,铀盐单染。双染色：醋酸双氧铀染色→漂洗→柠檬酸铅染色→漂洗→干燥。双染色较为常用。材料样品取材后可用丙酮清洗样品表面，直接包埋（渗透、包埋、聚合），超薄切片、电子染色（锇酸熏染）。

仪器信息网讯 2013年4月19日中国科学仪器行业最高级别的峰会——“2013中国科学仪器发展年会(ACCSI 2013)”在京召开。该会由中国仪器仪表行业协会、中国仪器仪表学会分析仪器分会、仪器信息网(www.instrument.com.cn)联合主办，我要测(www.woyaoce.cn)协办。 　　当天下午，作为此次年会的分论坛之一，“样品制备技术论坛”准时召开，吸引了厂商、专家、学生等相关人员80余位到场。中国农业科学院质量标准与检测技术研究所残留检测研究室主任王静博士主持了此次论坛。 中国农业科学院质量标准与检测技术研究所残留检测研究室主任 王静博士 样品制备技术论坛现场 　　中国仪器仪表学会分析仪器分会理事长、中国科学院大连化学物理研究所仪器分析化学研究室主任关亚风博士做了题为“绿色样品前处理技术进展”的报告。 中国科学院大连化学物理研究所仪器分析化学研究室主任关亚风博士 报告题目：绿色样品前处理技术进展 　　关亚风报告中主要介绍了固相萃取、固相微萃取、搅拌棒固相萃取、液相微萃取、加压溶剂萃取、基质固相分散萃取及QuEChERS六种绿色样品前处理技术，着重介绍了固相微萃取样品前处理技术。关亚风介绍说，将通过特殊处理过的19根玻璃毛细管内衬在石英衬管中开发的集束毛细管固相微萃取，对含六种多环芳烃的水样进行萃取，采用自制的热解析装置与GC-FID联用进行检测，350ml水样2分钟，检出限可达0.8-1.7ng/L。此技术已转让给北京普析通用仪器公司，预计2013年产业化。 中国检验检疫科学研究院食品研究所 王震博士 报告题目：食品样品制备中的关键控制点与设备现状 　　王震在报告中首先介绍了食品中样品前处理的重要性，并指出了传统样品前处理技术的关键控制点，包括：均质、离心、液液萃取、浓缩等。在现代样品前处理技术中，王震介绍说，固相萃取中有四个关键控制点：1、要防止浑浊样品堵塞柱子 2、要注意控制柱载量，防止穿透过载 3、一般SPE柱要防止干涸 4、要严格控制上样液和洗脱液滴速。报告中对凝胶渗透萃取、加速溶剂萃取、超临界流体萃取、基质辅助固相萃取等多种样品制备技术做了原理和特点的介绍。 弗尔德莱驰(上海)贸易有限公司中国区总经理 董亮先生 报告题目：如何选择合适的实验室马弗炉 　　董亮在报告中介绍说，马弗炉按照结构可分为箱式炉和管式炉。他说，在选择箱式马弗炉时要分六步骤：首先要注意样品种类和应用方向，是做灰化、焙烧还是热处理?其次是选择的马弗炉最高温度要比长时间工作温度高100度 其炉膛尺寸要比工作所需的炉膛有效尺寸大10% 马弗炉温度的均匀性在选购时很重要 样品处理时是否会产生大量的气体和杂质需要特别注意，而人们常常忽略 在马弗炉选型的最后要确定控温方式。管式马弗炉的选型与箱式马弗炉略有不同：在第三步时，要注意均温区长度 在第五步时要注意使用的气体类型。 军事医学科学院卫生学环境医学研究所 高志贤研究员 报告题目：仿生分子印迹识别材料的研制及应用 　　高志贤首先在报告中介绍了分子印迹技术的产生和发展历程，详细介绍了分子印迹的基本原理及分子印迹材料的基本特性。高志贤着重介绍了分子印迹材料在固相萃取中的应用，并列举了应用实例。报告中介绍了将分子印迹与表面等离子体共振(SPR)和压力传感器(QCM)技术联用后的检测实例，及这两项技术的优缺点和改进措施。高志贤介绍说，将分子印迹技术与光子晶体材料联用，可将目标分子的识别过程直接转变为可读的光学信号，实现裸眼比色检测。应用此项技术可研发一种高灵敏、高选择、便携的现场快速检测新技术。 上海新仪微波化学科技有限公司市场部经理 汤启立博士 报告题目：新仪微波样品前处理解决方案 　　汤启立介绍说，微波消解就是利用微波加热封闭容器中的消解液(各种酸、部分碱液以及盐类)和试样，从而在高温增压条件下使各种样品快速溶解的湿法消化。此项技术可应用在食品药品、农副水产品、饲料、环境等多个领域。汤启立列举了微波消解在“毒胶囊”、土壤、水、大气及饲料中的应用实例。汤启立介绍说，MASTER系列高通量微波消解仪消解罐采用宇航复合纤维材料制得，结实耐用，独特的稳压测控技术精确控温控压 双磁控管，变频微波电源，精确控制，缩短样品制备时间 高通量，一人一天可处理140个样品。 中国农业科学院 王淼博士 报告题目：分子识别样品前处理技术 　　王淼介绍说，按照原理可将分子识别技术分为免疫亲和技术、适配体技术、受体-配体技术、超分子材料和分子印迹技术。报告中分别介绍了这五种分子识别技术的原理和应用情况。王淼介绍说，核酸适配体是经体外筛选技术筛选出能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段，对可结合的配体有特异的识别能力和高度的亲和力。与抗体相比，核酸适配体易固定化、易保持构象、固定相表面的覆盖率高、稳定性好、变异性后容易恢复。因此将核酸适配体固定在固定相上，可实现目标物的色谱分离和检测。 现场观众提问 撰稿：孙立桐