人类蛋白质组

蛋白质组学是一门新兴但发展迅速的学科。近年来，国际上主要发达国家和地区纷纷加大了对蛋白质组学的支持力度，这一研究领域也由此成为各强国科技角力的新战场。10月12～13日，以“蛋白质组学：前沿与挑战”为主题的第381次香山科学会议在北京举行，与会的59名海内外科学家围绕蛋白质组学发展趋势及需求等议题展开了深入讨论。会议执行主席、中国科学院院士、军事医学科学院院长贺福初接受了记者的专访。 《科学时报》：举办此次香山科学会议的目的是什么？贺福初：蛋白质组学是揭示生命现象和规律的必由之路，已成为21世纪生命科学与生物技术的重要战略前沿和主要突破口，蛋白质组学研究已成为本世纪各国争夺最激烈、最重要的战略制高点之一。中国是较早开展蛋白质组学研究的国家之一，2006年初国家发布了《国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006—2020）》，明确提出要将蛋白质组学研究作为重点发展方向。“十一五”期间，我国蛋白质组学研究发展迅速并步入国际先进行列。2011年将是我国“十二五”规划的开局之年，为做好未来五年蛋白质组学的研究工作，明确主要发展方向和科学问题，探讨包括蛋白质组学设施在内的我国生命科学大设施的战略部署、建设和管理，我们在金秋十月的北京召开了这次香山科学会议。与会专家中不仅有多位两院院士和国内在不同领域作出突出成绩的中青年科学家，还有多位海外科学家，他们不远万里来到中国，共同为推动中国蛋白质组学研究向更高层次和水平发展献计献策。《科学时报》：请您简要介绍一下最近十年来国际蛋白质组学发展情况。贺福初：2001年国际人类蛋白质组组织的成立，极大地推动了蛋白质组研究的发展。10年来，国际蛋白质组学无论从技术方法和研究策略，还是研究资源和研究领域等都有了质的飞跃。近年来在蛋白质组定量分析，翻译后修饰研究、规模化相互作用及功能研究、生物标志物的筛选验证、抗体制备、数据标准和数据挖掘等方向取得一系列突破性进展。其中值得一提的是，蛋白质组学技术已成为几乎所有国际著名医学研究机构的重要支撑平台，在疾病研究中的应用十分广泛。国际上也先后启动了多种疾病的蛋白质组研究计划，目标是直接寻找疾病相关特异蛋白质或对疾病相关已知蛋白质进行深入机制分析。不久前在澳大利亚悉尼召开的第九届国际蛋白质组大会上，国际人类蛋白质组组织在总结前几年国际人类蛋白质组计划各先期计划经验的同时，宣布全面启动实施国际人类蛋白质组计划。该计划的全面实施势必全面带动科学技术及生物产业的发展，中国有必要也有能力在这一宏大计划中发挥主流作用。《科学时报》：蛋白质组学研究将呈现怎样的发展趋势？贺福初：蛋白质组学技术的迅速发展，其学术理念和技术方法已广泛应用于生命科学各个领域，如疾病发生发展的分子机制研究，疾病生物标志物的发现和验证研究等，蛋白质组学的广泛应用给蛋白质组学的发展提供了更多的需求和发展方向。随着蛋白质组学的快速发展及其在多个领域中的广泛应用，其发展的重点也发生了转变，逐渐从全蛋白质组研究向亚细胞蛋白质组研究转变，从定性描述向定量分析转变，由静态研究向动态研究转变，由体外研究向体内研究转变，从实验室研究向临床应用拓展，数据产出由数量向质量转变，由简单积累向有效整合以及知识挖掘转变。蛋白质组学不仅自身发展迅速，而且作为生命科学与生物高技术的新一代引擎，将带动大量相关学科领域的快速发展，为生命科学的研究、生物技术的应用和人类疾病的预防诊治带来新的革命。如通过与基因组研究的对接，极大推动基因组的全面阐释，通过其强大的需求牵引和突出的集成融合，推动分析科学与技术、信息科学与技术、材料科学与技术等学科在生命科学与生物高技术中的深层次应用和各自的快速发展，为我国经济社会的全面、协调、可持续的发展提供强大的科技原动力和战略性基础性支撑。《科学时报》：我国蛋白质组学研究都取得了哪些重要成就？贺福初：我国政府历来重视和支持蛋白质组学的发展，过去的十余年间，在国家发改委、科技部、自然基金委以及军队和省市科技主管部门等的大力支持下，我国蛋白质组学研究迅速发展壮大，并有力地推动了国际蛋白质组学研究的快速发展。研究重心从最初的以建立技术平台，开展技术方法的研究、整合为主，逐步向以高通量的蛋白质组研究技术平台为基础，解决事关我国人民健康的重大疾病问题和重要生命科学问题转移。涉及的领域除医学及人类自身对象以外，还涵盖了生命科学以及农业、林业、环境、资源、能源、工业等领域中的植物、动物、微生物等。无论是在蛋白质组学技术方法，还是在重要生物学功能和重大疾病相关的蛋白质组研究方面，我国科学家都取得了一系列令国际学术界瞩目的重要成就。2004年中国科学家首次在国际蛋白质组学最权威的专业刊物《分子细胞蛋白质组学》发表文章，近几年该刊物几乎每期都发表中国科学家的工作成果，甚至同期刊登来自同一个科研单位的三篇文章，据统计，中国科学家在国际蛋白质组学主要刊物《分子细胞蛋白质组学》、《蛋白质组研究》和《蛋白质组学》上发表的论文数量已位列世界第二位。由我国科学家倡导并领衔的国际人类肝脏蛋白质组计划，率先提出和建立了组织/器官的蛋白质组研究框架、模式和标准，为国际人类蛋白质组计划的全面展开和顺利实施发挥了普遍的示范和指导作用。我国科学家还广泛参与了国际人类蛋白质组计划的其他分计划，如血浆蛋白质组等，一批与重大疾病和重要生物功能相关的蛋白质组研究取得明显进展。《科学时报》：如何加快我国蛋白质学研究的发展？贺福初：面对生命科学前沿的领域，重大科学问题、涉及国民经济社会发展的重要应用领域的广泛需求，蛋白质组学从技术层面还有很大的发展空间。2011年是“十二五”规划的开局之年，有关部门针对蛋白质组学的发展现状和趋势，已调研论证并开始着手部署“十二五”期间的蛋白质组专项，尤其是面对“国际人类蛋白质组计划”的全面实施，有关“中国人类蛋白质组计划”的相关建议也已开始调研论证。不久前，国家发展和改革委员会批准分别在北京和上海建设国家蛋白质科学基础设施，这是我国首个在生命科学领域建设的大科学设施。其中，北京设施（简称“凤凰工程”）以蛋白质组学为主，由军事医学科学院作为项目法人，联合清华大学、北京大学和中国科学院生物物理研究所等共同建设，将为我国蛋白质科学，尤其是蛋白质组学的发展提供重要支撑，大幅提升我国蛋白质组学研究能力，有力保障重大科学研究计划（蛋白质科学研究计划）和“人类蛋白质组计划”等大型科技计划顺利实施，并为国内外广大用户提供高水平的技术服务。同时也为今后生命科学领域的其他大设施的部署、建设和管理发挥重要的示范和指导作用。在政府的支持下，我们应该抓住蛋白质组学发展的新契机，立足国际发展前沿，加强蛋白质组学新技术新方法的研究；在建设国家蛋白质科学基础设施的基础上，充分整合现有蛋白质组研究基础，建立完善国家层面的蛋白质组学协作网络；结合国际人类蛋白质组计划的全面实施，整合国内优势力量，加快启动实施“中国人类蛋白质组计划”；综合我国产出的海量人类蛋白质组数据，建立以中国为主的蛋白质数据库，积极推进蛋白质组数据对人类基因组的注释，并全面揭示生理功能调控规律和病理机制；推进前期基础研究成果的转化，为重大疾病预防诊治和创新药物研发提供理论基础、技术支撑，和具有重要应用价值的诊断试剂、药物靶点及新型药物，加强蛋白质组学在农业、工业、环境、资源、能源、林业等领域研发中的广泛应用将有力地推动我国蛋白质科学技术实现跨越式发展。《科学时报》 (2010-11-29 B1 中国生物产业)

2003年人类基因组精细图绘制完成，是人类科学史上一个里程碑式的事件。后基因组时代的研究重点自然落在了蛋白质头上。为啥？因为中心法则告诉我们，基因的产物——蛋白质，是生命活动的最终执行者。与基因组类比，研究生物体内全套蛋白质的科学，就是蛋白质组学。基因组计划完成的同年，人类蛋白质组计划启动，令人激动的是，2014年人类蛋白质组的草图也完成了。而蛋白质组学能够飞速发展的最大功臣非质谱莫属。质谱的应用范围非常广泛，但这里只讨论蛋白质组学中的质谱。简单地说，质谱法（mass spectrometry）就是对肽段离子的重量（质荷比，m/z）进行测量的分析方法。样品经质谱仪（mass spectrometer）检测得到质谱图（mass spectrum），通过对质谱图的分析就可以对样品中的蛋白进行鉴定、定量。亲，图1的这种典型的蛋白质组学流程都很熟悉吧。蛋白首先都要被特异性的酶（通常为Trypsin）切割为肽段，再进行后续分析，这在蛋白质组学中被称为“自下而上”的研究策略（Bottom-up proteomics）。我们平时见到的质谱分析基本都是这种类型。提到蛋白质组，即会联想到一系列高大上的名词，iTRAQ、SWATH、SILAC、Shotgun、Label-free等等。很多概念容易弄混淆，下面我们就来理理清楚。图1. 典型的蛋白质组学流程大体上，质谱研究蛋白主要是鉴定和定量。通过二级质谱图（MS2或者MS/MS）进行数据库搜索匹配鉴定蛋白。通过各种标记或非标记的手段对不同样品中的蛋白进行比较就是定量。蛋白定量比较是质谱最重要的用途，图2是对定量方法的一个简单总结。非标定量（Label-free）不需要标记，不同样品分别处理、分别进质谱检测；优点是处理简单、无需标记、价格便宜、可以比较很多组样品，缺点是对操作步骤、LC、质谱稳定性要求严格。SILAC是在细胞培养基中加入稳定同位素标记的氨基酸，在代谢水平标记蛋白，一级质谱图进行定量，可以做到三组样品混合后进行比较，定量准确，但是不能标记组织样本，养细胞成本也较贵。双甲基化标记是通过化学反应的办法在肽段水平进行标记，一级质谱定量，也可以三组对比，标记试剂都比较便宜，而且可以标记任何来源的样品。iTRAQ和TMT是商品化的试剂盒，肽段水平标记，二级质谱定量；分别可以做到最多8组和10组样品间蛋白质组的比较。图2. 质谱定量方法以上这几个是一家的，还有几个名词是属于另外一家，比如Shotgun (DDA)、SWATH/DIA、SRM (MRM)、MRMHR/PRM。质谱进行数据采集的方式大致分为三种：鸟枪法（Shotgun）、选择反应监控（SRM）和全景式的SWATH/DIA。下面对照图3再来简单介绍一下。图3. 质谱扫描方式DDA、IDA、Shotgun和鸟枪法说的是相同的东西，意思是质谱在每个循环的中从一级里挑选丰度高的TopN个肽段去打碎做二级扫描，得到的结果通过与已知数据库中的理论蛋白进行匹配。DDA简单有效，分析流程比较成熟，也是目前质谱分析的主流方式。DDA也有其固有的缺陷，即具有一定的随机性，偏向于检测丰度较高的肽段，而抑制了低丰度肽段的检测。靶向策略被称为质谱领域的Western blot。质谱只去采集目标肽段大小的离子信息，因而提高了灵敏度和特异性。这种方法用来研究感兴趣的特定蛋白，定量准确，但是通量很有限。SWATH/DIA这种全景式的数据采集方式在最近几年突然火了起来，被认为在不远的未来可能会取代DDA的主流位置。该方法采取的策略是将扫描范围内的所有肽段按照质荷比分为若干个窗口，再对每个窗口里所有的肽段一起打碎，采二级，数据分析时通过抽提蛋白的子离子信息进行定量。SWATH/DIA解决了DDA中随机性选择肽段的缺陷，所以重复性更好，定量的准确性基本达到了SRM的水平，而且可以实现大规模定量。借用听来的一个比喻来说明：DDA就像机关枪扫射，数量多、体积大的目标命中的概率要大一些。靶向扫描（SRM或PRM）就像精准狙击，排除干扰，目标明确，每一枪直指目标，但是难以大规模消灭敌人。SWATH/DIA就是地毯式轰炸，只要暴露在我方攻击范围内的敌人，不管三七二十一，全部炸完。图4. 定量方法与采集方式结合如果将上述的定量方法（图2）和质谱数据采集方式（图3）结合起来，就得到了现在基于质谱的蛋白质组学研究的各种策略（图4）。再打个比方，保证吃货们一听就懂：鸡、鱼、肉、蛋、蔬菜要通过炒锅、烤箱、高压锅、微波炉等烹调之后才能变为美食，填饱肚子。同样的，各种定量方法（非标的和标记的）处理的样品，要通过质谱各种采集方式变为电脑中的数据，才能分析并从中得到蛋白的信息。本次的介绍就先到这里了，如果其中有什么问题，欢迎您批评和建议，我们会努力变得更好；如果需要跟我们进行技术交流和讨论，欢迎大家联系武汉金开瑞。后续我们还会继续推出对质谱技术各方面进行解析的文章，敬请期待。ReferencesA draft map of the human proteome. Nature 509: 575–581 (2014)Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature 509: 582–587 (2014)A review: Annu. Rev. Biochem. 80: 273–99 (2011)SILAC: Molecular & Cellular Proteomics 1: 376-386 (2002)iTRAQ: Molecular & Cellular Proteomics 343: 91–99 (2010)SRM: Nature Methods 9: 555–566 (2012)SWATH: Molecular & Cellular Proteomics 11: 1–17 (2012)

PH值为4.6时沉淀的一类蛋白质是什么？