四溴酚蓝

(一)碱裂解法提取质粒[实验原理]碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复Ph至中性时，共价闭合环状质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，在而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。[实验仪器与设备]1.恒温培养箱 2.恒温摇床3.台式离心机(最大转速4000rpm) 4.冷冻高速离心机5.高压灭菌锅 6.超净工作台7.微量移液器 8.eppendorf tupe、tip[实验材料]1.葡萄糖 2.三羟甲基氨基甲/烷(Tris)3.乙2胺四乙酸(EDTA) 4.氢氧/化钠5.十二烷基硫酸钠(SDS) 6.乙酸钾7.冰乙酸 8.氯/仿9.乙醇 10.胰RNA酶11.氨苄青霉素 12.蔗糖13.溴酚蓝 14.酚15.β巯基乙醇 16.盐酸17.含pUC18质粒的大肠杆菌附：试剂的配制1.溶液Ⅰ50mmol/L 葡萄糖5mmol/L 三羟甲基氨基甲/烷(Tris) TrisHCl (pH8.0)10mmol/L 乙2胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)2.溶液Ⅱ0.4 mol/L NaOH, 2%SDS, 用前等体积混合3.溶液Ⅲ5mmol/L 乙酸钾 60 ml冰乙酸 11.5 ml水 28.5 ml4.TE缓冲液10mmol/L TrisHCl1 mmol/L EDTA(pH8.0)5.70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回)6.胰RNA酶将RNA酶溶于10mmol/L TrisHCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min,缓慢冷却至室温，保存于-20℃。7.终止液:40%蔗糖、0.25%溴蓝酚8.酚[实验步骤](一) 提取质粒1.将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。2.取1.5ml培养物倒入微量离心管中，4000rpm，离心2min。3.吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。4.将细菌沉淀悬浮于100μl溶液Ⅰ中，充分混匀，室温放置10 min。5.加200μl溶液Ⅱ(新鲜配制)，混匀内容物，将离心管放冰上5 min。6.加入150μl溶液Ⅲ(冰上预冷)，盖紧管口，颠倒数次使混匀。7.1200rpm，离心15 min，将上清转至另一离心管中。8.向上清中加入等体积酚：氯/仿(去蛋白)，反复混匀，12000rpm，离心5min,将上清转移到另一离心管中.9.向上清加入2倍体积乙醇,混匀后,室温放置5-10min。12000rpm离心5min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。10.用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。11.加50μl TE缓冲液，其中含有20μg/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20℃保存。(二)琼脂糖凝胶电泳检测DNA[实验原理]琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭(ethidum bromide ,EB)，在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。琼脂糖凝胶有如下特点：(1) DNA的分子大小 在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。(2) 琼脂糖浓度 一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。(3) 电压 低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。(4) 电泳温度 DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。(5) 嵌入染料 荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。(6) 离子强度 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液)，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。对于天然的双链，常用的几种电泳缓冲液有TAE、TBE等，一般配制成浓缩母液，室温保存，用时稀释。[实验仪器与设备]1. 恒温培养箱2. 琼脂糖凝胶电泳系统3. 高压灭菌锅 4. 紫外线透射仪[实验材料]1.三羟甲基氨基甲/烷(Tris) 2.硼/酸3.乙2胺四乙酸(EDTA) 4.溴酚蓝5.蔗糖 6.琼脂糖7.溴化乙锭 8.DNA marker9.DNA样品[实验步骤]1.缓冲液的配制① 5×TBE(5倍体积的TBE贮存液)配1000ml 5×TBE:Tris 54g硼/酸 27.5g0.5mol/l EDTA 20mlPh8.0② 凝胶加样缓冲液(6×)溴酚蓝 0.25%蔗糖 40%③溴化乙锭溶液(EB) 0.5μg/ml2.制备琼脂糖凝胶按照被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：琼脂糖凝胶浓度 线性DNA的有效分离范围0.3% 5-60 kb0.6% 1-20 kb0.7% 0.8-10 kb0.9% 0.5-7 kb1.2% 0.4-6 kb1.5% 0.2-4 kb2.0% 0.1-3 kb3.胶板的制备(1) 用高压灭菌指示纸带将洗静、干燥的玻璃板的边缘(或电泳装置所皿备的塑料盘的开口)封住，形成一个胶膜(将胶膜放在工作台的水平位置上，用水平仪校正)。(2) 配制足够用于灌满电泳槽和制备凝胶所需的电泳缓冲液(1×TBE)。准确称量的琼脂糖粉。缓冲液不宜超过锥瓶或玻璃瓶的50%容量。 在电泳槽和凝胶中务必使用同一批次的电泳缓冲液，离子强度或pH值的微小差异会在凝胶中形成前沿，从而大大影响DNA片段的迁移率 。(3) 在锥瓶的瓶颈上松松地包上一层厚纸。如用玻璃瓶，瓶盖须拧松。在沸水浴或微波炉中将悬浮加热至琼脂糖溶解。注意：琼脂糖溶液若在微波炉里加热过长时间，溶液将过热并暴沸。应核对溶液的体积在煮沸过程中是否由于蒸发而减少，必要时用缓冲液补充。(4) 使溶液冷却至60℃。加入溴化乙锭(用水配制成10mg/ml的贮存液)到终浓度为0.5ug/ml，充分混匀。(5) 用移液器吸取少量琼脂糖溶液封固胶模边缘，凝固后，在距离底板0.5-10mm的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。如果梳子距玻璃板太近，则拔出梳子时孔底将有破裂的危险，破裂后会使样品从玻璃板之间渗透。(6)将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶模中。凝胶的厚度在3-5mm之间。检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。(7)在凝胶完全凝固后(于室温放置30-45分钟) ，小心移去梳子和高压灭菌纸带，将凝胶放入电泳槽中。低熔点琼脂糖凝胶及浓度低于0.5%的琼脂糖凝胶应冷却至4℃，并在冷库中电泳。(8)加入恰好没过胶面约1mm深的足量电泳缓冲液。4.加样DNA样品与所需加样缓冲液混合后，用微量移液器，慢慢将混合物加至样品槽中。此时凝胶已浸没在缓冲液中。 一个加样孔的最大加样量依据DNA的数量及大小而定，一般为20-30μl样品。已知大小的DNA标准，应同时加在凝胶的左凝胶的左侧和右侧孔内。确定未知DNA的大小。测量未知DNA的大小时，要所有样品都用相同的样品缓冲液。5.电泳在低电压条件下,线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系,但是,在电场增加时,不同相对分子质量的DNA片段泳动度的增加是有差别的。因此，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围随之减小。为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。当溴酚蓝指示剂移到到距离胶板下沿约1-2cm处，停止电泳。

一、蛋白样品制备　　之前和大家介绍过细胞和组织蛋白质的提取，当我们做WB的时候，需要对提取好的蛋白样品进行处理：在蛋白样品中加入SDS loading buffer 6X（蛋白上样缓冲液）稀释至1X（如蛋白样品有120ul，则加入SDS loading buffer 6X 600ul），混匀，75-95度加热10-15分钟，使蛋白变性以充分暴露抗原位点。在加热结束后，进行离心，使蛋白样品适当降温，防止PAGE胶被融化。　　PS：要测量的蛋白如果是磷酸化形式，一般加热到75度，一般情况可95度加热。市面上买到的SDS loading buffer 有2X的也有5X的，最后稀释至1X即可。　　那么为什么我们加入SDS loading buffer呢？主要就是用它的不同成分在电泳中起了关键的作用。　　SDS loading buffer 的主要成分及作用：A：0.1%溴酚蓝，作为指示剂，方便观察电泳进行的程度；B：10%甘油，密度大，增加样本的重量，可携带样本沉到底部；C：2%SDS，是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，按一定比例和蛋白质分子结合成为复合物，是蛋白质带满负电荷，从而是蛋白带电荷一致，减少电荷对电泳结果的影响；D：巯基乙醇还原剂，使蛋白质的二硫键断开，使得蛋白保持线性结构。　　二、蛋白上样　　1. 将之前配好的胶固定在电泳装置上，加入1X电泳液　　2. 拔出梳子，应该两侧同时用力，缓慢拔出，注意在拔除梳子时防止气泡进入梳孔使其变形，若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正。　　3.加入蛋白样品，一般10孔的梳孔，每孔可以加入20ul -40ul蛋白样品，15孔的梳孔，每孔可以加入10ul -30ul蛋白样品，是用微量注射器加样，平时我们也可以用普通的移液枪加样，尽量让枪头深入梳孔底物，防止蛋白样品飘出，一般在目的蛋白两侧加入等量的marker，如果两侧有空的梳孔，应该加入1X的loading buffer，起“压边”作用，可以使蛋白样品在一条水平线上往下跑。　　4.电泳：接上电极，正负极不要弄反，红色对红色，黑色对黑色，初始电压设为90V，当样品跑至分离胶时将电压调至120V，一般在溴酚蓝跑出胶时停止电泳，也可根据目的蛋白的分子量来选择跑的时间，如分子量较大，可以延长电泳时间，使得分子量大的marker跑的分散开，容易判断分子量。　　三、注意事项　　1.蛋白样品上样量最好相等，不要过多。　　2.不要过多重复使用电泳Buffer　　3.最佳分辨区在分离胶的2/3　　4.电泳后测定的分子量有10%的误差，不可完全信任。有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上的肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链，SDS-PAGE电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量，有的蛋白质（如电荷异常或结构异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质）不能采用该发测相对分子量。　　5.如果电泳中出现拖尾，染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。

第九届科学仪器网络原创大赛(后简称：大赛，点击进入活动页面)自7月1日开赛以来，已经进行60天，来自全国各地的网友积极响应，征集到400余篇参赛作品。9月大赛正在如火如荼进行中，大赛设有12个分赛区，分别为：色谱、质谱、光谱及X射线、材料测试、食品检测、药物分析、环境监测、样品前处理、实验室建设及认可、仪器采购、国产好仪器、综合 征文类型涉及行业综述、分析方法开发与应用、新技术发展、仪器维护维修、仪器操作使用经验、实验室管理方法与建设、仪器选型、采购交流等多个方面。 大赛参赛方法：进入活动专题网站(点击)，按照提示操作即可，或者直接将参赛内容以帖子形式发表在相应版面，标题格式采用：【第九届原创】+ 标题内容；即可参赛。 8月份原创大赛获奖公示——不能错过的原创大餐 大赛征文已经进入倒计时，在此感谢各位坛友对活动的积极支持与关注，感谢各专区的负责人、专家评审团成员及论坛版主和专家对活动的积极响应，欢迎更多的网友们加入进来，分享您的经验与心得。 大赛8月共有43篇作品获得月度奖励，感谢大家对原创大赛的喜爱。现将8月作品获奖情况公布如下：质谱赛区参赛作品作者名次柱子初始温度对峰型的影响小结jimzhu一等奖气相色谱-串联质谱法测定玩具产品中10种有机锡yezi7414二等奖ICPMS2000B测试高纯硝酸中的痕量超痕量元素含量xsh1234567二等奖ICP-MS测定血和尿液中矿物元素jianqian1211三等奖四酸分解-电感耦合等离子体质谱法同时测定地质样品中20种杂质元素abcpgf三等奖色谱赛区参赛作品作者名次用不同代dionex产品组成一套完整复杂的多功能离子色谱仪系统konglong一等奖农产品中氨基甲酸酯类农药检测的液相色谱条件优化研究violet978二等奖小部件大智慧——U3000微滴计数器v3109824二等奖AC110V电磁阀用于安捷伦7820A色谱仪阀驱动danmaishenqiu三等奖茶叶儿茶素组分液相方法开发的心酸历程v2900054三等奖岛津LC-20AT输液泵漏液报警故障的排除v2960432三等奖一次气相色谱仪ECD检测器污染修复feigekai三等奖光谱赛区参赛作品作者名次722S可见分光光度计电路解析sc360xp二等奖原子荧光光谱法测定水系沉淀物、土壤、岩石中硒qq250083771二等奖温度对锂离子电池性能的影响v3137340三等奖VARIAN 自动进样器SPS3维修记xurunjiao5339三等奖材料赛区参赛作品作者名次2016国产磁测量与应用好仪器设备系列之三：记一次天津飞旋磁悬浮真空涡轮分子泵FX1200的测试handsomeland一等奖食品赛区参赛作品作者名次食品包装容器（玻璃瓶、陶瓷瓶）中的重金属在酒类产品中迁移研究huangza一等奖新技术2：溴酚蓝指示剂的CIE 1976（L，a，b）色空间数字化特征hhciq一等奖中国乳制品相关产品标准、检测标准及质量控制zfxly二等奖秋葵的农药超标了？zyl3367898二等奖牛奶相对密度的介绍及创新应用zhouyuhu三等奖利用EXCEL自动处理竞争ELISA数据qzxmsy三等奖食品中的二氧化硫残留量是否超标v3134100三等奖小心驶得万年船v2862195三等奖药物赛区参赛作品作者名次氢化物原子荧光光谱法测定中药材及保健食品中痕量锗huangza二等奖样品前处理赛区参赛作品作者名次样品无机化的好伙伴——谈谈我与莱伯泰科ED54型电热石墨消解仪的故事jieqian1211三等奖乙醚并不“迷人”——一次仪器试用记v3129005三等奖环境赛区参赛作品作者名次挥发性有机物检测过程中突发性灵敏度降低至十分之一的原因分析yzhlai一等奖便携式X荧光对土壤重点治理区的筛查wangliqian二等奖图解M40多气体检测仪维修与保养danmaishenqiu三等奖实验室赛区参赛作品作者名次巧用Excel 2007解决Worklist盲样输入问题icetrob一等奖车内空气中甲苯浓度测定不确定度评定-蒙特卡洛模拟法zzg2002二等奖秀一只45年前韦斯顿电池，见识电化学对电磁计量科学的贡献sc360xp三等奖JJG229—2010给出的测量不确定度评定方法会导致错误选用检定标准pxsjlslyg三等奖测量系统分析在实验室中应用v2685125三等奖化验，听我细说（二）——分析测试，离我们有多远？yue_qiu三等奖国产好仪器赛区参赛作品作者名次国产气相色谱仪的洪荒之力-v2651621三等奖综合赛区参赛作品作者名次【第九届原创】一款化妆品中非法添加糖皮质激素类药物的检测nphfm2009二等奖仪器人，幸运与不幸v3137745三等奖新法实施，食品安全治理全面升级——新《食品安全法》解读T107283三等奖温度对锂离子电池性能的影响v3137340三等奖浅谈化学分析中的不确定度T107283三等奖 8月原创作品查重——严抓质量，提示品质 第九届原创大赛专题页面：http://www.instrument.com.cn/activity/2016yc/ 第九届原创大赛主办单位： 仪器信息网 我要测网 第九届原创大赛协办单位： 中国仪器仪表学会 第九届原创大赛支持单位： 仪品汇电商平台 中国仪器仪表学会近红外光谱分会 第九届原创大赛赞助单位： 东曹(上海)生物科技有限公司 青岛盛瀚色谱技术有限公司 岛津企业管理(中国)有限公司 赛默飞世尔科技(中国)有限公司集团 广州市尤瓦化工产品有限公司 贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司 科学仪器网络原创作品大奖赛介绍： 科学仪器网络原创作品大奖赛以仪器信息网为平台，倡导“鼓励创新、积极分享、促进交流”的理念。大赛至今已成功举办七届，参与人数超过2000人，累计征集作品近7000篇。深受业内用户的欢迎和支持，树立了良好的品牌活动形象。仪器厂商参与原创大赛，可以加强口碑宣传、促进公司品牌的提升、改善用户对产品的认知度和认可度。